刘莉莉 文正华 单晓政 张文慧 贺丽霞 宋文芹 孙德岭 江汉民

摘 要： 黑腐病是影响青花菜生产的主要病害之一，为了更好地研究该致病菌的致病机制和十字花科蔬菜对其抗性的分子机制，从发病田间采集具有典型症状的病害标样，对病原菌进行分离、纯化，并对其形态特征、理化特性和致病性进行了分析，同时测定了该菌株23S rDNA和hrcC基因序列，分析了与近缘细菌23S rDNA和hrcC基因序列的同源性，构建了系统发生树，比较了2种基因对相似细菌的检测和鉴别能力，结果表明，hrcC基因用于该致病菌的鉴定更具优越性。根据分离菌的表型特征及分子特征，判定该分离菌为青花菜黑腐病的致病菌-野油菜黄单胞杆菌野油菜致病变种。

关键词： 青花菜；黑腐病；23S rDNA；hrcC基因

Abstract： The black rot caused by Xanthomonas campestris pv. Campestris is one of the main disease affecting broccoli production. In order to study the pathogenic mechanism of the pathogenic bacteria and the molecular mechanism of crucifer resistance to the pathogen， diseased samples with typical symptom were collected and representative strains were selected to determine morphology， cultural characters， straining reaction， physiological and biochemical reactions and pathogenicity of pathogen. In addition， the 23S rDNA and hrcC gene were partially sequenced and compared with the sequences deposited in databased， molecular phylogentic trees were constructed based on two genes. The results showed that hrcC gene analysis may be a more useful tool for interspecies identification. The isolates were identified as Xanthomonas campestris pv. Campestris based on their phenotepic and molecular characteristics.

Key words： Broccoli； Black rot； 23S rDNA； hrcC gene

青花菜又名青花椰菜、西兰花。十字花科芸薹属甘蓝种中以绿花球为产品的一个变种，是国际畅销的一种名特蔬菜，具有很高的营养保健价值。近年来随着消费需求逐年增加，种植面积不断扩大，轮作倒茬时限越来越短，黑腐病的危害呈逐年加重的趋势，该病的成因及预防也是科研工作者关注的焦点问题。十字花科黑腐病由革兰氏阴性植物病原菌Xanthomonas campestris pv. campestris （Xcc）引起的，是一種能使全球范围内所有十字花科植物形成黑腐病的重要病害[1]，其发病普遍且危害严重，染病后引起叶脉变黑、叶片枯死，影响植株光合作用，造成产量和花球品质的下降。该病对危害甘蓝类蔬菜（Brassica oleracea）（包含青花菜）的生产，流行年份枯死率可达30%以上[2-4]，许多科研工作者致力于十字花科植物特别是甘蓝类蔬菜抗黑腐病的遗传规律，以及对致病菌侵染的应答模式、基因的筛选及抗病机制的探寻等方面的探寻[5-7]。笔者特别针对危害本地区青花菜生产的黑腐病病原菌进行分离、纯化，对其形态特征、理化特性和致病性进行分析，同时对该菌的23S rDNA和hrcC基因的部分序列进行测序，比对分析近缘细菌23S rDNA和hrcC基因序列的差异，比较2种基因对该致病菌的检测和鉴别能力，旨在为对该致病菌的准确、快速有效鉴定及进一步研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 病原菌的分离、纯化

青花菜黑腐病发病叶片采于天津市武清区大孟庄镇青花菜种植基地。2016年10月30日取样，所选取的病样为典型黑腐病发病初期叶片，病叶干净无虫食，病样采集后于取样袋中带回，4 ℃存放，24 h内进行分离、纯化，具体参照《微生物学试验技术》提供的方法进行[8]，纯化后的菌株命名为TJ4401并保存于NYGB培养基中，-80 ℃存放。每次使用时在Kings B固体培养基上划线培养以恢复细菌活性，然后回接于青花菜叶片上使其恢复致病能力，重新分离、纯化后用于接种试验[9]。

1.2 病原菌的鉴定

1.2.1 病原菌的回接鉴定 根据Koch法则，为进一步确定所得到的病原菌为青花菜黑腐病的致病菌，将病原菌稀释成1×108 cfu·mL-1的悬液，针刺法回接到青花菜感病品系上，以接种无菌水的为对照，接种后24 h保持90%以上的相对湿度，14 d后观察发病情况。

1.2.2 形态学及生理生化鉴定 对分离的单菌落，稀释后涂布于Kings B固体培养基上，28 ℃培养72 h，对长出的菌落进行形态、色泽等方面的观察。同时参照Meyer D等[8]的方法对其进行生理生化等方面的鉴定，主要包括鞭毛银染、明胶液化、淀粉酶水解、革兰氏染色等。

1.2.3 病原菌的分子鉴定 CTAB法提取病原菌的基因组DNA[10]，根据GenBank提供的植物病原细菌23S rDNA的序列设计23S rDNA的扩增引物，同时根据近缘植物病原细菌hrcC基因的DNA序列设计引物，利用多重序列比对工具ClustalX 2.0分析后，根据Xcc特有的序列位点设计特异引物，具体序列见表1。

采用FastPfu DNA Polymerase进行扩增，以Xcc菌株B100的基因组DNA为阳性对照。PCR结束后1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。PCR扩增产物进行纯化后，按照pGEM-T easy（Promega，USA）载体试剂盒提供的方法与载体进行连接。连接产物转化E.coli感受态细胞JM109，挑选阳性克隆进行测序，测序结果在NCBI上进行比对。在GenBank里搜索已发表的植物病原菌的23S rDNA序列，和本试验所测序列分别进行菌株进行比对。用MEGA 6.0计算不同菌株之间遗传距离并建立聚类分析树状图。

2 结果与分析

2.1 病原菌的菌落特征和形态

在Kings B固体培养基上菌落近圆形，初呈淡黄色，后变为蜜黄色，边缘完整，略凸起，薄或平滑，具光泽，初步确定所分离的病原菌为青花菜黑腐病的致病菌（图1）。

2.2 病原菌的回接鉴定

将采集的黑腐病病样经分离、纯化后，按Koch法则回接到青花菜感病系，14 d后所有接种植株的发病率为100%，叶片接种部位出现典型的“V”字形病斑。而对照无菌水接种区域没有出现病变。以上说明所分离的病原菌为青花菜黑腐病致病菌（图2）。

2.3 病原菌的生理生化鉴定

对病原菌进行了革兰氏染色、鞭毛银染、明胶液化、淀粉酶水解等生理生化特征的分析和观察（图3）。从显微镜下观察到菌体呈杆状，长度为0.3～0.7 μm，极生鞭毛，无芽孢，菌体单生或链生，革兰氏染色阴性。

2.4 病原菌的分子鉴定结果

为进一步对所分离病原菌进行鉴定分析，以提取的病原菌基因组DNA为模板，PCR扩增23S rDNA，琼脂糖凝胶电泳结果显示2 679 bp处有清晰地电泳条带，与预期结果相符（图4）。23S rDNA扩增产物测序后与GenBank数据库进行比较，结果显示所分离的来自发病叶片的菌株的23S rDNA的序列为该菌种特异性片段，与菌株ATCC33913、B100 ICPM4013、ICPM21080及8004 23S rDNA的序列相似性为99%，但与同属黄单胞菌属的近缘细菌（如Xanthomonas gardneri、Xanthomonas oryzae 、Xanthomonas vesicatoria 、Xanthomonas arboricola 、Xanthomonas gardneri 、Xanthomonas cynarae 、Xanthomonas hortorum 、Xanthomonas bromi 、Xanthomonas arboricolap、Xanthomonas pisi 、Xanthomonas fragariae 、Xanthomonas cucurbitae 、Xanthomonas cassavae 、Xanthomonas vasicola 、Xanthomonas perforans 、Xanthomonas euvesicatoria 、Xanthomonas axonopodis等）的序列同源性也为99%。系统发育学分析结果表明，我们所分离的致病菌菌株TJ4401与菌株17、B100、ATCC 33913及8004位于同一分支（图5）。

用同样的方法对病原菌的致病相关基因hrcC的部分序列进行扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物大小与阳性对照的扩增结果一致（图5）。测序结果证实该片段与GenBank公布的Xcc菌株17、B100、ATCC 33913及8004的序列同源性均为100%，与黄单胞菌属其它致病菌的同源性均低于96%；系统发育学分析结果表明，我们所分离的致病菌菌株TJ4401与菌株17、B100、ATCC 33913及8004位于同一分支（图6），进一步证实了所分离的病原菌为青花菜黑腐病的致病菌（图7）。

3 讨 论

病原细菌的鉴定方法很多，形态学、生理学和生态特征是传统的鉴定方法，随着分子生物学技术的发展，DNA序列分析已成为国际上细菌分类鉴定常用的技术手段[11]，而细菌的核糖体RNA基因（rDNA）是细菌进化过程中比较保守的基因，病原细菌16S和23S rDNA二者结构均由保守区和可变区构成，不同菌种间，保守区序列差异较小，可变区序列随菌种亲缘关系的亲疏不同而各有差异，常被用来研究细菌进化过程的亲缘关系以及作为分类的标准[12]。但相比之下，16S rDNA序列在原核生物中的保守性较高，难以鉴别相近种或同一种内的不同菌株。23S rDNA基因分子比較大，其变异性亦高于rDNA基因中其它基因，其变异性更适合进行常见致病微生物的鉴别[13]。研究人员常选取该基因的部分保守序列进行基因扩增，比较不同细菌种属间的差异，并用于细菌的鉴别诊断。笔者基于23S rDNA的序列同源性比对结果不能将供试菌株与亲缘关系较近的菌种区别开来，仅能在系统发育学分析上能将其与亲缘关系较近的菌种有效取分；而基于hrcC基因的序列同源性比对及系统发育学分析均可以明显地将检索出的近缘菌种区别开来。可见，在黑腐病致病菌的检测和鉴定方面，hrcC基因比23S rDNA更具优越性。

参考文献

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