钟 霞，王 丽，王洪连，沈宏春，徐川岚，刘育杭

(1.四川省泸州市西南医科大学附属中医医院中西医结合研究中心,四川 泸州 646000；2.四川省泸州市西南医科大学，四川 泸州 646000)

肝纤维化(Liver Fibrosis)的发生与慢性肝损伤的病因有关，包括乙型肝炎和丙型肝炎、饮酒、脂肪肝、胆汁淤积和自身免疫性肝炎，表现为肝脏细胞外基质合成与降解的失衡，若纤维化持续进展，会出现肝脏结构紊乱和功能受损，诱发肝硬化、肝衰竭，甚至导致肝癌发生[1]。目前防治肝纤维化已成为研究热点，而构建一种有效的肝纤维化动物模型是进行肝纤维化研究的重要基础。采用四氯化碳(CCl4)化学诱导方式建立肝纤维化模型，是常用的一种简单、快速、高效的造模方式，而不同品系的小鼠对于该造模方法的敏感性不同，模型构建的结果也会有所差别。本实验分别对两种品系小鼠采用CCl4诱导肝纤维化造模方式进行造模，对比观察两者肝脏结构和功能等方面的差异，以探求一种高效、稳定的肝纤维化疾病模型。

1 资料与方法

1.1实验动物：选择30只ICR(Institute of Cancer Research)小鼠和30只C57BL/6小鼠，SPF级，均为雄性，8周龄，体重20～25 g，购自西南医科大学SPF动物实验中心[许可证：SYXK(川)2013-065]。

1.2药物与试剂：CCl4溶液购于成都金山化学试剂有限公司；橄榄油购于上海生工生物工程股份有限公司(批号：C316BA0013)；正置荧光显微镜购自日本尼康公司；全能型蛋白转印系统购自美国Bio-rad公司；苦味酸-天狼星红染色试剂盒购于上海博谷生物科技有限公司(批号：PT036)；苏木素伊红(HE)染色试剂盒购于碧云天试剂有限公司(批号：C0105)；Fibronectin抗鼠单克隆抗体购自abcam公司(货号：ab11575)；collgen-I、collgen-III抗体购自Cell Signaling Technology 公司；ɑ- SMA抗兔单克隆抗体购自abcam公司。

1.3方法

1.3.1模型建立及标本采集：ICR小鼠和C57小鼠各30只，适应性喂养1周后，将ICR小鼠随机分为ICR正常组、ICR阴性对照组(橄榄油)、ICR模型组；将C57小鼠分为C57正常组、C57阴性对照组和C57模型组，每组各10只，自由饮水和进食。用橄榄油将四氯化碳分析纯配制成20% 的CCl4混悬液。两模型组予以腹腔注射2 ml/100 g 20% CCl4混悬液，1次/d，每注射5 d，间隔2 d，连续8周；两组对照组予以注射相同剂量橄榄油，正常组不做任何处理。观察小鼠活动状态、饮水量、精神状况及体重变化等一般情况。8周后，戊巴比妥钠麻醉，收集全血分离血清；收集肝脏组织，部分暂时冻存于-80℃，部分予以4%多聚甲醛固定、脱水、石蜡包埋。

1.3.2检测肝脏功能：各组小鼠连续给药8周后，腹腔注射麻醉，收集全血分离血清，全自动生化分析仪检测血清AST、ALT水平，评估肝脏功能损害。

1.3.3观察肝脏组织病理形态：采集肝脏组织，用10%中性甲醛固定，脱水包埋后石蜡切片。对肝组织切片进行HE和苦味酸-天狼星红染色，光镜观察病理形态和结构变化。

1.3.4Western blot检测肝纤维化相关指标蛋白水平：称取小鼠肝组织 0.05 g，提取肝组织蛋白。取50 μg蛋白进行 SDS-PAGE 电泳，经PVDF膜转移后，用5% 脱脂牛奶室温封闭1 h，分别加入Fibronectin、α-SMA、Collagen Ⅰ及Collagen Ⅲ一抗(稀释比例 1∶1 000)4 ℃ 孵育过夜，TBST洗涤3×5 min，加入辣根过氧化物酶(HRP)偶联二抗(稀释比例1∶3 000)常温孵育1 h，TBST 洗涤3×5 min后，采用凝胶成像仪进行检测，结果以目标蛋白和内参的相对灰度值表示。

1.3.5Real time PCR检测肝纤维化相关指标mRNA水平：采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)法测定组织α-SMA mRNA水平的表达。用trizol法提取组织总 RNA，1%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测所得总RNA的纯度和浓度，再用cDNA合成试剂盒逆转录合成cDNA，最后进行Real-time PCR反应，反应条件为95 ℃ 10 min，40 个扩增循环(95 ℃ 15 s，55℃ 15 s，72 ℃ 30 s)。Real-time PCR反应体系如下：SYBR green PCR mix 10 μl，上下游引物各0.5 μl，稀释cDNA 9 μl，共计20 μl。每个样本重复测量3次，用2-△△Ct法分析目的基因相对表达量。引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司设计合成，见表1。

2 结果

2.1各组小鼠血清AST、ALT含量测定结果：与对照组比较，2个模型组的小鼠血清ALT、AST水平均明显升高(P<0.05)，而ICR小鼠模型组和C57小鼠模型组相比，ICR小鼠的AST、ALT含量明显增高(P<0.05)。见表2。

2.2病理组织学结果

2.2.1肝脏HE染色结果：两正常组及两对照组肝小叶结构清晰，肝索围绕中央静脉呈放射状排列，小叶间和汇管区基本无胶原纤维分布。C57小鼠模型组肝小叶结构紊乱，肝细胞颗粒变性明显，可见肝细胞脂肪变性。ICR小鼠模型组可见肝细胞内大量脂肪空泡堆积，脂肪变性较C57模型组更为明显，另外可见中央静脉周围纤维增多并向外延伸，形成纤维间隔。见图1。

表1引物基因序列

组别AST ICR小鼠 C57小鼠 ALT ICR小鼠 C57小鼠 正常组125.800 0±8.786130.800±12.91139.000±7.51658.000±9.848对照组145.200 0±18.660166.600±33.21549.000±17.02991.600±30.753模型组4 222.800±1 034.243①3 052.200±585.951①3 473.400±1 669.293①2 376.600±500.397①

注：与对照组比较，①P<0.05

图1 两种品系小鼠苏木精伊红(HE)染色比较(200×)：A：ICR小鼠正常组；B：ICR小鼠对照组；C：ICR小鼠模型组；D：C57小鼠正常组；E：C57小鼠对照组；F：C57小鼠模型组

2.2.2肝脏苦味酸-天狼星红染色结果：两正常组及两对照组肝小叶结构正常，肝细胞排列整齐，仅有少量血管壁着红色。C57小鼠模型组肝脏肝小叶结构遭到破坏，汇管区及中央静脉周围大量着红色的纤维组织增生，形成纤维间隔及假小叶，肝细胞排列紧密性下降，肝细胞出现脂肪变性。与C57小鼠模型组相比，ICR小鼠模型组可见大量粗大的胶原纤维沉积，纤维间隔更多更宽，肝小叶结构破坏更加严重，肝细胞出现脂肪变性，另外可见部分肝细胞坏死。

2.3Western bolt检测纤维化通路相关蛋白 ：蛋白免疫印迹法检测各组小鼠肝组织中Fibronectin、α-SMA、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ的蛋白含量，与对照组比较，两组CCl4模型组均明显增高(P<0.001)；而两组小鼠模型组相比较，ICR模型组的Fibronectin、α-SMA、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ含量上升更明显，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3、图4。

图3 各组小鼠肝组织Western blot结果：A：ICR小鼠正常组；B：ICR小鼠对照组；C：ICR小鼠模型组；D：C57小鼠正常组；E：C57小鼠对照组；F：C57小鼠模型组

图4 各组小鼠肝组织纤维化相关蛋白检测结果：A：两种小鼠的模型组与对照组比较，④P<0.001；B：ICR小鼠模型组与C57小鼠模型组比较，①P<0.05，②P<0.01，③P<0.01

2.4Real-time PCR检测肝纤维化相关基因：实时荧光定量PCR检测两种品系小鼠肝组织中α-SMA、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ mRNA的表达，与对照组比较，两组CCl4模型组中α-SMA、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ mRNA的表达均明显升高，且差异有统计学意义(P<0.001)；而两组小鼠模型组相比较，ICR小鼠模型组的Fibronectin、α-SMA、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ含量上升更明显，差异有统计学意义(P<0.05)。见图5。

图5 各组小鼠肝组织Real-time PCR结果：A：两种小鼠的模型组与对照组比较，③P<0.001。 B：ICR小鼠模型组与C57小鼠模型组比较，①P<0.05，②P<0.01

3 讨论

肝纤维化的产生是一个极其复杂的过程，发病机制主要是多种因素通过不同方式和途径作用于肝脏中的肝星状细胞(HSC)以及纤维形成细胞，导致其生物学及功能变化，导致肝纤维化的发生[2-3]。经多种临床研究发现，在纤维化发展的早期阶段，去除原发病因可有效减缓纤维化甚至使其逆转并恢复至正常结构，因此，在肝纤维化治疗过程中，及时阻断或延缓纤维化的发生是肝脏疾病预后的关键。中医药通过降低肝纤维化大鼠TGF-β/Smads通路和及P-STAT3、P38MAPK、a-SMA的表达从达到改善肝功能，减轻肝损害，抑制肝纤维细胞个胶原纤维的增生，进而发挥抗纤维化的作用[4-5]。目前，建立肝纤维化模型的方法大致有腹腔注射CCl4、胆总管结扎、复合多因素法和二乙基亚硝胺诱导等，不同的方法其诱导肝纤维化产生的机制也不同[6-8]。CCl4作为应用最广泛的化学性肝毒性物质，其简便、快捷、成功率高的优点是建立肝纤维化动物模型是使用最多的方法[9-11]。本实验通过对肝纤维化模型小鼠肝功能指标检测及肝组织病理学观察，对比分析不同种属之间肝纤维化造模程度的差异，证实在相同的实验条件下腹腔注射CCl4致小鼠肝纤维化，ICR小鼠对CCl4诱导肝纤维化的造模方式更为敏感，肝纤维化程度明显高于C57小鼠。