刘宁，孙鹤鸣，赵怡雯，马雪萍，陈健康，魏从文，钟辉，杨晓莉

1.武警总医院 检验科，北京 100039；2.第四军医大学 西京医院检验科，陕西 西安 710032；3.军事科学院 军事医学研究院 生物工程研究所，北京 100850

转化生长因子β（transforming growth factor β，TGF-β）是一类结构、功能与生长相关的细胞因子，参与调控多种细胞生物学效应，包括细胞增殖、分化及凋亡。TGF-β有6种亚型，其中TGF-β1亚型的活性最强，发挥主要的生物学功能[1]。迄今发现哺乳动物体内至少表达3种TGF-β（TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3）的配体，TGF-β1亚型在人体肝脏中的表达最丰富，并且参与调控多种慢性肝脏疾病的发生发展。

肝脏纤维化是各种慢性肝病的病理基础，而TGF-β1能促进肝星状细胞（hepatic stellatecells，HSCs）异常活化，使细胞外基质（extracellular ma⁃trix，ECM）过度沉积，加快成肌纤维细胞的纤维化病变[2-3]。在肝纤维化患者及CCl4诱导的肝纤维化小鼠模型中，发现TGF-β1蛋白及mRNA的表达都升高[4]；TGF-β是上皮细胞-间充质转化（epi⁃thelial-mesenchymal transition，EMT）的重要调节因子，研究发现当TGF-β1刺激肝癌细胞时，低表达Smad7或过表达Smad3/4的细胞EMT增强[5]；在肝癌患者中TGF-β通过诱导EMT使癌细胞获得较高的迁移与侵袭、抗凋亡和降解ECM的能力，促进肝癌的不良预后发展[6]。

高尔基蛋白73（Golgi protein 73，GP73）是一种Ⅱ型跨膜糖蛋白，由粗面内质网合成，位于高尔基体中。在正常肝脏中GP73少量表达并维持肝脏正常生理功能，而在各种肝脏疾病中表达增高，如病毒性肝炎、肝纤维化、肝癌等[7-8]。研究认为，GP73作为诊断早期肝癌的血清标志物有较高的临床价值，此外GP73水平还与肝癌组织的分化程度密切相关[9]。Zhang等认为在肿瘤免疫微环境中γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ）能够诱导GP73表达上调[10]；GP73还能通过调控EGFR/RTK、TGF-β1/Smad2等信号通路促进肿瘤生长、侵袭和转移[11-12]。然而，肿瘤发生发展过程中GP73表达升高和调控的机制尚不完全清楚。在肝细胞癌中，GP73与TGF-β信号通路均是肿瘤进程中的重要靶分子与信号通路，GP73高表达提示我们考虑是否TGF-β能够调控GP73的表达。然而，GP73与TGF-β信号通路之间的关系尚未见报道。在本研究中，我们的结果表明TGF-β能激活GP7启动子，上调GP73 mRNA和蛋白水平。

1 材料与方法

1.1 材料

人肝癌细胞HepG2由本实验室保存；质粒pcDNA3-Flag-GP73为本实验室构建和保存；DMEM培养基购自Gibco公司；GP73抗体购自Santa Cruz公司；胎牛血清、α-tubulin抗体购自Sigma公司；兔抗山羊IgG/辣根过氧化物酶、羊抗小鼠IgG/辣根过氧化物酶购自北京中杉金桥公司；质粒转染试剂jetPRIME购自Polypluse公司；TRIzol-A+总RNA提取试剂、2×TS Reaction mix、gDNA Remover、TransS⁃cript RT/RI Enzyme mix、Anchored Oligo（dT）18Primer、TransStart Top Green qPCR SuperMix（2×）购自Tiangen公司；hGP73引物（Forward：5′-TGGCCTGC ATCATCGTCTTG-3′；Reverse：5′-CCCTGGAACTCGT TCTTCTCA-3′）由奥科生物技术服务公司合成；Daul-Luciferase Reporter Assay试剂盒购自Pramega公司。

1.2 细胞培养及转染

用含10% 胎牛血清、100 mmol/L链霉素、100 mmol/L青霉素的DMEM培养基，在含5% CO2的37℃培养箱中培养HepG2细胞。以60 mm的培养皿为例，新传代的HepG2生长到60% ～80% 时给细胞换新鲜的培养基2 mL。

准备2支EP管，各加入200 μL jetPRIME Buffer，分别加入Flag-GP73质粒、Flag-V质粒各2 μg，漩涡振荡 15 s，再各加入 jetPRIME Reac⁃tion Reagent 8 μL，涡旋混匀 15 s，静置 10 min后将配好的转染工作液加入细胞培养基，4 h后更换新鲜的DMEM培养基补齐至4 mL，转染24 h后收取细胞进行下一步操作。

1.3 免疫印迹

根据收取的细胞数量加入适量的4×SDS上样缓冲液，煮沸10 min，12 000 r/min离心10 min，取上清进行SDS-PAGE，根据蛋白marker的电泳情况判断目的蛋白的跑胶位置，待目的蛋白分离开后即可转膜（转膜条件：18 V，1.5 h）；用含5% 脱脂奶粉的1×TBST室温摇床孵育1 h封闭PVDF膜，封闭后用1×TBST洗膜3～5 min，重复3次，室温孵育一抗1 h或4℃孵育过夜，用1×TBST洗膜，重复3次，每次5 min；加入酶标二抗，室温摇床孵育 1 h，用 1×TBST洗膜 5 min，重复 3次；用Western Lighting Plus ECL试剂显影。

1.4 细胞总RNA提取，反转录PCR，荧光定量PCR

弃去培养基，用1×PBS轻柔洗涤细胞2次，弃去PBS，直接在平皿内加入1 mL TRIzol-A+裂解细胞，用加样枪吹打几次并将细胞悬液移至无RNA酶的离心管内，在超净工作台内静置5 min使核酸蛋白复合物完全分离；加200 μL氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15 s，室温放置3 min后4℃、12 000 r/min离心10 min，样品会分成不同颜色的3层，RNA主要存在于无色水相层；将约500 μL水相用加样枪移至新的无RNA酶离心管中，加入等体积的异丙醇，漩涡振荡混匀，室温放置30 min，4℃、12 000 r/min离心10 min，弃上清留取管侧和管底的白色胶状沉淀；用无RNA酶的ddH2O配制的75% 乙醇1 mL洗涤沉淀，轻柔吹打混匀，4℃、5000 r/min离心3 min，弃去上清，室温放置3 min；根据管底白色胶状沉淀的量加入适宜量的DEPC水，反复混匀，充分溶解RNA沉淀；取1 μL用分光光度计测定RNA浓度，记录并保存备用。

以RNA为模板反转录合成cDNA，反应体系包括 2 μg 总 RNA、1 μL Anchored Oligo（dT）18Primer、10 μL 2×TS Reaction Mix、1 μL TransS⁃criptRT/RI Enzyme Mix、1 μL gDNA Remover，用无RNA酶的水补齐反应体系至20 μL，42℃孵育30 min，85℃孵育5 min。

最后进行荧光定量PCR，以2 μL cDNA为模板，加入 10 μL TransStart Top Green qPCR Su⁃perMix（2×），hGP73的上、下游引物各0.5 μL，用ddH2O补齐反应体系至20 μL。扩增条件：94℃孵育5 s，56℃孵育15 min，72℃ 10 min。

1.5 双萤光素酶报告实验

将HepG2细胞传至12孔培养板中，用TGF-β按实验条件处理细胞，然后将细胞培养基弃去，用适量的1×PBS轻柔洗涤细胞，避免细胞脱落，尽可能将漂洗培养板的PBS吸出；每孔加入200 μL 1×裂解缓冲液（PLB），于摇床上室温裂解15 min，得到细胞裂解液，用于检测萤光素酶；取30 μL细胞裂解液加入EP管中，再加入30 μL萤光素酶检测试剂（LAR），混匀后用荧光光度计检测发光值，然后加入测定作为内参的海肾萤光素酶的30 μL反应终止液，并测得其发光值，二者的比值为萤光素酶的相对活性（relative luciferase activity，RLA）。

1.6 统计学处理

数据均以x±s表示，采用Graphpad Prism 5进行数据分析，组间数据比较采用Dunnettt检验，P＜0.05认为差异有统计学意义（*P＜0.05，**P＜0.01）。

2 结果

2.1 TGF-β在蛋白水平影响GP73的表达

用2 ng/mL TGF-β1刺激分别转染了Flag-V、Flag-GP73质粒的HepG2细胞，在不同时间（0、1、2、4、8 h）点收取细胞并裂解，制样进行 West⁃ern印迹，检测在TGF-β1的刺激下细胞内GP73的表达情况。结果表明，在处理1 h后，不论是否转染过表达GP73的质粒，GP73蛋白的表达水平都显著升高，Flag-V对照组4 h达到高峰并持续到8 h，而过表达GP73组2 h达到峰值，4或8 h后有所下降（图1A）。下一步又检测了不同浓度（0、1、2 ng/mL）TGF-β1刺激转染了Flag-V、Flag-GP73质粒的HepG2细胞，处理时间8 h，Western印迹结果显示GP73的表达对TGF-β1处理的浓度有剂量依赖性（图1B）。结果提示，GP73的表达水平受到TGF-β1刺激的影响，表现为时间依赖性和剂量依赖性。

图1 TGF-β在蛋白质水平影响GP73的表达

2.2 TGF-β在mRNA水平影响GP73的表达

既然TGF-β能影响GP73蛋白的表达，我们猜测TGF-β是否影响GP73 mRNA水平的表达。用2 ng/mL TGF-β1刺激HepG2细胞不同的时间（0、1、2、4、8 h），或用不同浓度（0、1、2 ng/mL）TGF-β1处理HepG2细胞8 h，收取各处理条件的细胞，提取细胞总RNA，反转录为cDNA后进行qPCR，比较不同处理条件的细胞与对照组细胞GP73 mRNA表达水平的变化。结果表明，GP73 mRNA在TGF-β1处理1 h后表达升高，4 h时达峰值，之后开始下降（图2A）；在0～2 ng/mL TGF-β1浓度范围内，GP73 mRNA表达水平随TGF-β1刺激浓度的升高而升高（图2B）。

图2 TGF-β在mRNA水平影响GP73的表达

2.3 TGF-β1能直接激活GP73启动子

TGF-β能在mRNA水平影响GP73的转录，那么TGF-β作为转录因子是否能与GP73启动子序列结合，从而影响GP73的转录水平？通过分析GP73基因的上游DNA序列，在距离启动子区域（转录起始位-1005～-998核苷酸处）有一个Smad结合元件（SBE，序列为CAGACA）。分别构建包含GP73启动子、GP73启动子突变体序列的萤光素酶报告基因质粒，SEB突变体序列为CACACA（图3A）。在HepG2细胞内分别转染这2种质粒，利用双萤光素酶报告基因方法检测TGF-β1是否能够直接激活GP73启动子。结果表明，TGF-β1刺激能够激活GP73启动子转录活性增高达6倍多，而当GP73启动子突变后，转录活性并没有升高（图3B）。

图3 TGF-β1能直接激活GP73启动子

3 讨论

在肝癌的发生发展中，TGF-β发挥双向调控作用。在肝癌早期，TGF-β主要通过Smad信号通路上调细胞增殖周期蛋白依赖性激酶CDKs抑制因子P15、P21的表达，使细胞的生长周期停滞，发挥抑制癌细胞生长的作用[13]；而在肝癌进展期，TGF-β可以降低IL-2的分泌，抑制抗原呈递细胞的抗原呈递作用，继而免疫T细胞的活化、增殖及B淋巴细胞产生免疫因子受到抑制而不能发挥正常的免疫杀伤功能，有助于肿瘤细胞发生免疫逃逸，加快肿瘤进展[14-15]；另一方面，TGF-β能促进肿瘤微环境中血管内皮生长因子（VEGF），结缔组织生长因子（CTGF）的分泌，加快肿瘤血管的生成，诱导成纤维细胞增殖和分泌ECM而加速肝脏细胞的纤维化进程[16]。据报道，肝癌组织中GP73显著升高，使细胞黏附分子E-钙黏蛋白减少，波形蛋白增多，促进肿瘤细胞的侵袭和迁移，与肝癌的不良预后息息相关[17]；肝细胞癌患者血清中TGF-β1的mRNA和蛋白水平均显著升高，TGF-β 1在肝癌组织中的表达水平、肿瘤大小与有无血管侵袭均有关[18]。而肿瘤组织中GP73蛋白表达升高的分子机制尚不可知，因此，我们推测TGF-β信号通路可能与GP73水平具有密切关系。

本研究中，我们从转录水平、翻译水平探讨了TGF-β对GP73表达水平的影响，结果表明TGF-β能与GP73启动子结合，增强GP73的转录水平，进而促进GP73蛋白的表达。因此我们有理由认为，肝癌组织中GP73蛋白的异常表达至少部分受TGF-β的调控，而GP73是否能够调控TGF-β信号通路有待进一步研究。