刘金蓉,李 映,田平芳,李可意,葛喜珍,*

(1.北京联合大学生物化学工程学院,北京 100023; 2.北京化工大学生命科学与技术学院,北京 100029; 3.生物质废弃物资源化利用北京市重点实验室,北京 100023)

沼液是禽畜粪便等有机物经厌氧发酵的残留液体[1]。沼液营养丰富,含丰富的氮、磷、钾、氨基酸、微量元素、B族维生素、多种水解酶、有机酸和腐植酸等生物活性物质,具抑菌和抗逆等功效[2]。研究发现,沼液与化肥配施时,能明显提高油菜产量和品质[3];果树灌溉沼液不仅能促进叶片生长,且果实膨大,品质明显改善[4];沼液作叶面肥喷施作物,叶片变厚、叶绿素含量增加,光合作用增强[5]。此外,沼液作叶面喷肥可防治病虫害,减少农药使用和农药残留[6],已有报道[7],沼液对粮食、经济作物、花卉、水果和蔬菜等24种作物中的40种病害具有一定的防治效果。虽沼液用途广泛,但部分沼液重金属超标、营养成分不完善[8-9],不能被有效利用,如何去除沼液中重金属、合理应用沼液是废弃物利用的重要研究方向。

小檗碱是从黄连、黄柏等植物中提取的异喹啉类生物碱[10],对多种G+、G-细菌、丝状真菌和酵母菌以及原虫均具抑制作用[11-12],对多种真菌和细菌性病害甚至对畜牧动物有抑菌、消炎活性,对蚜虫、螨类等具有防治活性,能清除田间杂草[13-15]。作为广谱农业杀菌剂,小檗碱环境相容性好、安全、对非靶标生物毒性低、植物病原真菌对其不易产生抗性、在自然环境中降解快,在无公害农业生产和绿色食品生产中有广阔的应用前景[16]。

肥料和农药是农业生产不可缺少的重要生产资料,对于减少病虫害、提高农产品产量和品质有着重要作用,农业生产中一般将二者分开施用,而现代农业要求农田作业尽量省时、高效、节约成本[17]。目前关于沼液与小檗碱复配的药肥一体化应用研究未见报道。本研究在沼液中添加氮、磷、钾矿质养分,将之与小檗碱配合,制备沼液药肥一体化水剂,并通过抑菌和植物生长试验初步证明此复合药肥的抑菌效果和肥效,为环境友好型沼液复合药肥一体化应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

小檗碱 西安科慧生物有限公司;磁石、石膏 安国长安中药材有限公司;沼液 由北京郊区农场提供;小白菜(绿星青菜品种) 中国农业科学院蔬菜花卉研究所;黄腐酸 上海伊卡生物技术有限公司;尿素、磷酸二氢钾 北京化工厂;硝酸钾 天津市福晨化学试剂厂;番茄灰霉病菌 由河北农业大学植保学院杨文香教授提供。

PDA培养基:土豆300 g;葡萄糖20 g;琼脂15 g;蒸馏水1000 mL。

MS105电子天平 北京北方首衡电子科技有限公司;85-2数显恒温磁力搅拌器 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司;HC014-11-018-01(X)立式灭菌锅 上海东亚压力容器制造有限公司;LRH-150生化培养箱 上海一恒科技有限公司;ZHJH-C1106C超净台 上海智城分析仪器制造有限公司;DHG-9023A电热恒温鼓风干燥箱 上海益恒实验仪器有限公司;PS-40A超声波清洗机 深圳市超艺达科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 沼液净化 将磁石和石膏分别粉碎,过80目筛,备用。取2 L沼液原液,将磁石和石膏粉末加入沼液,磁石和石膏的投加量分别为60、70 mg,以260 r/min搅拌26 s,然后以50 r/min 慢速搅拌25 min,沉淀60 min,过滤,取上清得溶剂I。向溶剂I中加入140 g硅藻土,以50 r/min搅拌30 min,沉淀35 min,过滤,取上清843 mL,得含沼液的溶剂II即为试验试样。

参照国家标准(NY/T 1973-2010水溶肥料水不溶物含量和pH的测定;NY/T 1976-2010水溶肥料有机质含量的测定;NY/T 1977-2010水溶肥料总氮、有效磷、钾含量的测定;NY/T 1974-2010水溶肥料铜、铁、锰、锌、硼、钼含量的测定;NY/T 1978-2010肥料汞、砷、镉、铅、铬含量的测定)取三次样品检测沼液净化前后的成分及基本理化性质的变化。

1.2.2 水溶肥料的制备 以沼液溶剂II为母液,选用尿素、磷酸二氢钾、硝酸钾、黄腐酸为供N、P2O5、K2O和腐植酸的原料[18],以“含腐殖酸水溶肥料(大量元素型)(NY1106-2010)”为标准,设计四因素三水平正交试验(因素水平排列见表1),以水不溶物含量为指标,筛选水溶肥料最佳配方,并按此配方制备水溶肥料。测定方法参照NY/T 1973-2010水溶肥料水不溶物含量。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal tests

1.2.3 沼液药肥一体化水剂的制备 采用超声后静置法[19]测定常温下小檗碱在水溶肥料中的溶解度(W/V),根据测得的溶解度确定小檗碱的添加量,将小檗碱与水溶肥料配合制备成沼液药肥一体化水剂,该水剂由中国农业科学院农业资源与农业区划研究所土壤肥料测试中心检测其中N、P、K等的含量。

1.2.4 小檗碱水剂和沼液药肥一体化水剂对番茄灰霉病菌毒力的影响 设置小檗碱水剂浓度梯度分别为32、64、128、256、512 μg/mL。配制上述浓度的加药(即加小檗碱)PDA培养基,用直径0.8 cm打孔器取培养96 h的番茄灰霉病菌菌饼,接种至上述PDA固体培养基,每处理重复3次,28 ℃培养。番茄灰霉病菌培养60 h后用十字交叉法测量菌落直径,按照式(1)计算抑制率[20-21]。根据机率值换算表,将抑制百分率换算成抑制机率值。以试验中设定的浓度对数为横坐标,抑制机率值为纵坐标,计算毒力回归方程和半数最大效应浓度(Concentration for 50% of maximal effect,EC50)。

沼液药肥一体化水剂中小檗碱浓度梯度为8、16、32、64 μg/mL。实验方法同上。

抑制率(%)=100×(空白组菌落直径-加药处理组菌落直径)/空白组菌落直径式(1)

1.2.5 沼液药肥一体化水剂对白菜生长的初步试验 本研究采用盆栽种植白菜,基质由蛭石、珍珠岩、草炭以1∶1∶2的比例混配,土壤组成按照壤土、基质、有机肥以1∶3∶1混匀即可[22]。试验设置不同浓度沼液药肥一体化水剂,共设6个处理,即水剂稀释50、150、300、400、500倍喷施及对照组(清水)。待供试白菜第3片真叶长出时开始第一次追肥,之后毎隔5 d追肥一次,追施第3次后采收[23]。测定指标包括:株高和生物量,株高测定:每个处理随机抽取6株,在营养生长盛期,用直尺测定植株的株高,株高测定时高度统一为从根茎连接处到顶端分支处;生物量测定:在生殖生长盛期采用电子秤测定不同处理的各植株地上部干重(60 ℃烘干)等。

1.3 数据处理

采用Microsoft Excel整理数据,采用SPSS Statistics软件处理数据,并进行显著性分析,显著水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 沼液净化结果

沼液净化前后的成分及基本理化性质实验结果如表2所示。

表2 沼液净化前后的成分及基本理化性质Table 2 Composition and basic physical and chemical properties of biogas slurry before and after purification

沼液净化后,其中的铁、锰、锌含量增加,铜离子及重金属离子含量明显降低。推测铁、锰、锌含量增加与磁石、石膏和硅藻土成分有关:磁石除主成分Fe元素含量高外,还含有丰富的Zn、Mn、Cu、Co、Ca等元素[24];石膏中除Ca元素外,主要含有Sr、Al、Fe、Mg、K等元素[25];硅藻土的成分中80%以上为SiO2·nH2O,也含有少量的Al、Fe、Ca、Mg、Na、K、P等[26]。而铜离子及重金属离子含量降低与石膏和硅藻土的性状有关:石膏比表面积大,硅藻土孔隙率高、比表面积大、吸附性能强、性质稳定且无二次污染[27],而且目前应用硅藻土处理铜离子和重金属离子已有报道[28-30]。

2.2 水溶肥料的配方筛选结果

水溶肥料配方筛选结果见表3。由极差分析结果可知,各个因素影响的主次顺序是磷酸二氢钾、硝酸钾、尿素、黄腐酸。由正交试验结果可知,最佳配方组合为A2B2C1D3,即尿素用量17%,磷酸二氢钾用量9%,硝酸钾用量10%,黄腐酸用量8%,沼液补至100%。

表3 正交试验结果Table 3 Results of orthogonal tests

2.3 沼液药肥一体化水剂检测结果

实验测定25 ℃下小檗碱在最佳配方中的溶解度为0.014%±0.002%(W/V),在最佳配方中添加0.01%小檗碱制成沼液药肥一体化水剂,其养分含量检测结果见表4,由表4可知,制备的沼液药肥一体化水剂N、P2O5、K2O含量分别为85.1、41.8、78.7 g/L,符合NY1106-2010标准，其中N、P2O5、K2O总和=205.6 g/L≥200 g/L,能满足作物对养分的需求。此沼液药肥一体化水剂中,药和养分的比例是1∶2056。

表4 沼液药肥一体化水剂检测结果Table 4 Test results of water soluble fertilizer

2.4 小檗碱水剂对菌毒力的影响

小檗碱水剂浓度梯度为32、64、128、256、512 μg/mL(图1),通过测定不同浓度梯度小檗碱水剂对番茄灰霉病菌的抑制率(表5),得毒力回归方程y=0.9124x+3.54439,决定系数R2=0.99333,当抑菌率为50%时,机率值Y=5.0000,小檗碱水剂抑制番茄灰霉病菌的EC50为398.11 μg/mL。

表5 小檗碱对番茄灰霉病菌的抑制率(60 h)Table 5 Inhibition rate of berberine on Botrytis cinerea(60 h)

图1 小檗碱对番茄灰霉病菌的抑制效果Fig.1 Effect of berberine on inhibition of Botrytis cinerea注:A1:空白对照;B1:小檗碱浓度32 μg/mL; C3:小檗碱浓度64 μg/mL;D2:小檗碱浓度128 μg/mL; E2:小檗碱浓度256 μg/mL;F1:小檗碱浓度512 μg/mL。

2.5 沼液药肥一体化水剂中小檗碱对菌毒力的影响

沼液药肥一体化水剂中小檗碱浓度梯度为8、16、32、64 μg/mL(图2),该水剂抑制番茄灰霉病菌的EC50为12.12 μg/mL。

图2 沼液复合杀菌对番茄灰霉病菌的抑制效果Fig.2 Inhibitory effect of compound disinfection of biogas slurry on Tomato Gray Mold注:A1:空白对照;B2:小檗碱浓度8 μg/mL; C2:小檗碱浓度16 μg/mL;A2:小檗碱浓度32 μg/mL; E2:小檗碱浓度64 μg/mL。

对毒力测定结果进行分析,沼液药肥一体化水剂的EC50与小檗碱水剂比较,降低了很多,要实现50%的抑菌率,沼液药肥一体化水剂中小檗碱用量仅为小檗碱水剂中的3.04%,明显减少了小檗碱用量。沼液药肥一体化水剂不仅能增强小檗碱作为生物农药的杀菌药效,且实现水肥一体化,大大降低了使用成本。

2.6 沼液药肥一体化水剂对白菜生长的影响

由图3可知,沼液药肥一体化水剂随着稀释倍数的增加,株高増长量呈先增加后下降的趋势,在稀释300倍时增长量最大,为14.36 cm;稀释150倍时,增长量次之,为13.83 cm;稀释400倍时,株高增长量为第三,增长值为12.71 cm。经方差分析可知,该水剂稀释300倍和150倍时对株高的影响显著大于稀释400倍(p<0.05),而稀释300倍和150倍的处理间差异不显著(p>0.05)。可能是稀释300倍时营养元素足够植株生长,稀释150倍时,营养元素也未过剩。而稀释50倍时营养元素过多,稀释400倍和500倍时由于稀释度过高,导致肥料中可用的N、P、K浓度太低,因而不足植株生长发育所需,使得生长效果不及稀释300倍时效果好。

图3 不同处理对白菜生长的影响Fig.3 Effects of different treatments on the growth of Chinese cabbage注:图中不同小写字母表示差异显著(p<0.05), 相同小写字母表示差异不显著(p>0.05),图4同。

由图4可知,对于白菜的地上部干重来说,沼液药肥一体化水剂稀释150倍时最高,稀释300倍时次之,稀释400倍时第三,依次是:2.61、1.62、1.44 g,可能是随着施肥量减少,作物养分减少,而施用稀释50倍的沼液药肥一体化水剂几乎无增产作用,推测是由于肥料的过量施用影响了作物对元素的有效吸收,同时肥料中过量的盐分集结容易使土壤结块,养分失衡,阻碍作物对养分物质的吸收转化[23]。经方差分析可知,该水剂稀释150倍对地上部干重的影响显著大于稀释300倍和400倍(p<0.05)。

图4 不同处理对白菜生物量的影响Fig.4 Effects of different treatments on biomass of Chinese Cabbage

综合分析各稀释倍数对白菜株高和生长量的影响,沼液药肥一体化水剂稀释150倍即养分含量为1.67 g/L时有助于白菜增产。

3 结论

将磁石和石膏与沼液混合,再加硅藻土净化、沉淀,能明显增加沼液中铁、锰、锌含量增加,铜离子及重金属离子含量明显降低。本研究首次制备添加小檗碱的沼液药肥一体化水剂,其最佳配比及原辅料为:小檗碱0.01%,尿素17%,磷酸二氢钾9%,硝酸钾10%,黄腐酸8%,沼液补至100%,制备的药肥一体化配方N∶P2O5∶K2O质量比:8.51∶4.18∶7.87。研究发现该水剂对番茄灰霉病菌有较强的抑制作用,EC50为12.12 μg/mL,为小檗碱水剂EC50的3.04%。白菜施用150倍稀释液即养分含量为1.67 g/L能有效加速植株生长。该研究为提高沼液抑菌效果和肥效,开发以沼液和小檗碱为主要原料的药肥一体化水剂提供科学参考。