李 毅,夏振海,魏思宇,陈璟玥,陈安格,李自强,陈佳翎,余嘉瑶,王 恬,钟 翔

(南京农业大学动物科技学院,江苏南京 210095)

肥胖已经成为一种常见的慢性疾病,在中国已经上升为社会问题。2017年最新健康调查数据显示,中国人的肥胖率已经达到17%。不同于欧美国家,中国式肥胖主要表现为腹部脂肪堆积,极易引起非酒精性脂肪肝、糖代谢异常、脂代谢紊乱、高血压、嘌呤代谢异常等疾病,严重影响到人们的日常生活,甚至会在表观遗传的作用机制下对后代产生影响。植物提取物作为一种天然、无污染的食品添加剂,在防治肥胖方面具有不良反应少、易于被大众接受等特点。有国外研究者曾从400多种植物中筛选出了44种能够抑制脂肪细胞脂质积累的粗提取物,其中葛根草、覆盆子、山茱萸提取物和尼泊尔老鹳草4种提取物具有显著活性,表现出高的脂肪抑制性,对肥胖具有高的治疗意义[1]。国内研究者也发现荞麦、余甘子等植物提取物在防治非酒精性脂肪肝、调控脂代谢方面具有积极的效果[2-3]。

白藜芦醇(Resveratrol)是一种主要存在于虎杖、葡萄、藜芦、花生等植物中的多酚类化合物。相关研究表明,白藜芦醇具有抗氧化、抗炎症、抗心血管疾病、抗肿瘤和调节免疫等一系列功效[4-5]。Baur等[6]研究表明,口服白藜芦醇可以安全地减少小鼠过量热量摄入导致的许多负面后果，如线粒体数量减少，并且能够调节已知的长寿途径，总体上改善健康和生存。Jeon等[7]研究表明,白藜芦醇能够起到缓解与肥胖有关的外周和中枢炎症和代谢紊乱,并且改善高脂日粮(HFD)喂养的糖尿病小鼠记忆缺陷的功能。宋昱等[8]研究发现,白藜芦醇对长期高脂日粮抑制的FoxO3a、catalase和MnSOD基因通路起到了积极的作用,从而改善高脂日粮诱导的氧化还原失衡。目前,对于白藜芦醇防治肥胖的研究主要集中在脂代谢方面,有关糖代谢和能量代谢的研究较少。本文通过探究白藜芦醇对高脂日粮诱导的肥胖小鼠生长性能、肝脏的脂质代谢、糖代谢和能量代谢等代谢指标及相关基因的表达,以期为与白藜芦醇的有关保健产品与食品的开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

所有日粮 南通特洛菲饲料科技有限公司,日粮配比参考AIN93标准[9]。LFD组饲喂TP 2330055MC饲料,原料包括酪蛋白、淀粉、糊精、蔗糖、豆油、矿物质混合物、维生素混合物、胱氨酸、胆碱、TBHQ(抗氧化剂)。低脂日粮,脂肪含量为10%;HFD组饲喂TP 2330055M饲料,原料包括酪蛋白、淀粉、蔗糖、猪油、矿物质混合物、维生素混合物、胱氨酸、胆碱、TBHQ。高脂日粮,脂肪含量为60%。

Bio-Gen Series PRO 200匀浆机 美国PRO Scientific公司;5804R型台式高速冷冻离心机 德国 Eppendorf公司;Thermo Nano Drop 2000 超微量可见光分光光度、QuantStudio 5 Real-Time PCR 仪 美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 实验方法

1.2.1 试验动物分组 40只健康的C57BL/6J雄性小鼠,预实验3周,按照体重随机分成4组,每组10只,分别为低脂日粮组(LFD)、低脂日粮+276 mg/kg白藜芦醇组(LR)、高脂日粮组(HFD)、高脂日粮+400 mg/kg白藜芦醇组(HR)[8，10]。低脂饲料热量:3.6 kcal/g,其中,脂肪热量10%,蛋白质热量14%,碳水化合物热量76%。高脂饲料热量:5.2 kcal/g,其中,脂肪热量60%,蛋白质热量14%,碳水化合物热量26%。即HR组白藜芦醇的添加量为0.04%条件下,LR组白藜芦醇的添加量为0.0276%,此时相同采食热量情况下,LR和HR组小鼠白藜芦醇含量相同。

1.2.2 饲养管理 所有小鼠于环境卫生良好的鼠房中同室分笼饲养,预饲养3周,正式试验为12周,小鼠自由采食和饮水,打耳标作标记。每天12 h/12 h光暗周期,室内温度维持在(23±2) ℃,湿度50%～60%。每2 d更换一次饲料,记录相应采食量,每周称重一次。

1.2.3 样品的采集 饲喂12周后,小鼠空腹24 h,称重,乙醚麻醉,摘眼球取血0.5～1 mL,颈椎脱臼处理小鼠,迅速取出肝脏置于预冷的生理盐水中漂洗,滤纸擦干后置于液氮中,然后放置于-80 ℃超低温冰箱中保存。

1.2.4 生长性能指标的测定 试验期间,每周称重,精确到0.01 g;每2 d更换饲料,记录采食量,计算日均采食量。

1.2.5 血清指标的测定 眼球取血置于1.5 mL无菌试管中,室温静置15 min,在4 ℃,3500 r/min条件下离心10 min,取上清,测定AST和ALT的活力,测定步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.6 肝脏中相关代谢指标的测定 于-80 ℃冰箱取出200 mg肝脏组织,按照质量(g)∶体积(mL)为1∶9的比例,在冰浴条件下使用相应的匀浆介质进行机械匀浆,于4 ℃、3500 r/min条件下离心10 min,取上清待测。在高脂模型条件下,采用无水乙醇为匀浆介质测定LPO和MDA,采用生理盐水为匀浆介质测定AST、ALT、Cu/Zu-SOD、HK、PK、SDH和MDH的酶活力,测定步骤严格按照试剂盒说明书进行。

需求情况：氮肥方面，尿素处于农业需求淡季，各地基本无农作物用肥需求；工业需求方面，胶板厂受大气污染治理影响，开工率无上升，复合肥企业开工率下滑，对尿素的采购需求减少。磷肥方面，国内冬储市场逐步展开，西北、东北市场到货量少，华北市场交投清淡；出口市场已接近收尾，部分企业仍有出口订单待发。钾肥方面，复合肥企业开工率下降，对钾肥的采购需求减少。复合肥方面，南方经济作物用肥需求减少，北方地区农业需求结束，冬储备肥预收为主，铺货不顺畅。

1.2.7 肝脏RNA的提取和mRNA表达量的测定 于-80 ℃冰箱取出100～200 mg冻存的肝脏样品,加入1 mL预冷的Trizol溶液,用美国MP FastPrep-24匀浆机匀浆,冰上静置5 min,加入200 μL氯仿振荡混匀后,置于冰上静置3 min,4 ℃、12000 g/min条件下离心15 min,取上清置于新的灭菌管中,并加入等体积的异丙醇沉淀核酸,-20 ℃静置30 min后,4 ℃、12000 g/min条件下离心10 min,弃上清,底部白色沉淀即是RNA,用75%的酒精洗涤沉淀2～3次,超净台晾干,加适量的无RNA酶的水溶解沉淀。采用Thermo Nano Drop 2000超微量可见光分光光度计测定RNA的浓度和纯度,10 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。用无RNA酶的水稀释到1000 ng/μL,采用TaKaRa反转录试剂盒进行反转录,所得20 μL的cDNA样品保存于-20 ℃待测。

mRNA表达量按照ChamQ SYBR qPCR Master Mix定量说明书进行测定。20 μL反应体系如下:2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10 μL,上游引物(10 μmol/L)0.4 μL,下游引物(10 μmol/L)0.4 μL,cDNA x μL,加ddH2O补充到20 μL。试验按照以下条件进行qPCR反应:预变性:95 ℃,30 s;40个循环反应:95 ℃,10 s;65 ℃,30 s;溶解曲线:95 ℃,15 s;60 ℃,60 s;95 ℃,15 s。试验结果以2-ΔΔCt来表示,内参基因为GAPDH。

本试验所用基因引物均由上海生工生物工程有限公司提供,引物序列见表1。

表1 实时荧光定量PCR引物序列Table 1 Real-time PCR primer sequence

1.3 数据处理

试验数据采用SPSS 20.0软件进行分析,首先采用一般线性模型(General liner model,GLM)进行主效应(日粮和白藜芦醇)及互作效应的差异显著性检验。采用单因素方差分析,Duncan’s进行多重比较,结果用平均值±标准差表示,p<0.01表示差异极显著,p<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 白藜芦醇对高脂诱导肥胖小鼠生长性能的影响

由表2可知,试验期间各试验组小鼠的体重均逐步增长。试验12周HFD小鼠的体重比LFD小鼠提高了28.24%(p<0.05),建模成功。与LFD小鼠相比,HFD小鼠平均体重在第4周、第8周和第12周分别显著增加了9.58%、16.94%、28.24%(p<0.05),说明在高脂日粮的条件下,HFD小鼠的体重远超于LFD小鼠,并与时间成正相关。与HFD小鼠相比,HR小鼠体重在试验8周和12周时分别降低了6.95%和10.71%(p<0.05),说明添加白藜芦醇能有效的缓解体重的增加。

表2 白藜芦醇对高脂诱导肥胖小鼠体重的影响(g)Table 2 Effect of resveratrol on weight of mice fed with high fat diet(g)

由表3可知,与LFD小鼠相比,HFD小鼠日均采食量在试验前4周和4～8周分别显著降低15.57%、9.48%(p<0.05),说明高脂日粮中能量较高,适口性低,小鼠采食量减少。在日粮中添加了白藜芦醇,与HFD小鼠相比,HR小鼠的日均采食量在试验前4周和4～8周分别显著提高了6.13%、19.10%(p<0.05);与LFD小鼠相比,LR小鼠的日均采食量在试验前4周、4～8周和后4周分别显著提高了24.04%、36.00%、29.66%(p<0.05),说明在高脂日粮和低脂日粮条件下,白藜芦醇均有提高适口性的作用。

表3 白藜芦醇对高脂诱导肥胖小鼠日均采食量的影响(g/d)Table 3 Effect of resveratrol on average daily feed intake of mice fed with high fat diet(g/d)

本研究发现,由于受到高脂日粮的影响,小鼠的体重显著增加(p<0.05),与时间成正相关,但相应的小鼠的采食量显著减少(p<0.05),可能由于高脂饲料脂肪含量太高,过于油腻,影响适口性。在高脂日粮中添加了白藜芦醇以后,小鼠的体重显著下降(p<0.05),采食量有所增加,但不显著(p>0.05)。宋昱等[8]研究表明,分别饲喂C57BL/6J雄性小鼠白藜芦醇添加量为0.04%和0.08%的高脂日粮12周,小鼠的体重显著下降,采食量无显著变化,其中添加0.04%的白藜芦醇的作用效果优于0.08%,与本试验研究结果一致。Ku等[11]研究表明,给SD大鼠每天灌胃10 mg/kg·BW 5周,大鼠的体重明显减轻。本试验研究还发现在低脂条件下,白藜芦醇的饲喂能够显著提高采食量(p<0.05),提示白藜芦醇可能有提高适口性的作用。

2.2 白藜芦醇对高脂诱导肥胖小鼠相关代谢的影响

2.2.1 白藜芦醇对高脂诱导肥胖小鼠血清和肝脏中AST、ALT活力的影响 由表4可知,与LFD组小鼠相比,HFD组小鼠血清中AST和ALT活力分别显著提高了57.51%和201.63%(p<0.05),肝脏中AST和ALT活力分别显著降低了24.50%和19.21%(p<0.05),说明肥胖对肝脏造成了损伤,导致血清中AST和ALT升高。与HFD组小鼠相比,HR组小鼠血清中AST和ALT活力分别显著降低了16.06%和62.87%(p<0.05);HR组小鼠肝脏中AST和ALT活力分别显著升高了31.70%和12.81%(p<0.05),说明白藜芦醇对肥胖引起的肝脏损伤起到缓解作用。

表4 白藜芦醇对高脂诱导肥胖小鼠血清和肝脏AST、ALT活力的影响Table 4 Effect of resveratrol on the activities of aspartateaminotransferase(AST)and alaninetransaminase(ALT) in the serum and liver of mice fed with high fat diet

AST和ALT是衡量机体肝脏损伤的重要指标。本研究发现,由于受到高脂日粮的影响,小鼠的血清中AST和ALT活力显著提高(p<0.05),肝脏中AST和ALT活力有所下降,说明肥胖可能造成机体肝脏损伤。高脂日粮中添加了白藜芦醇以后,小鼠的血清中AST、ALT均显著减少(p<0.05),肝脏中AST、ALT均有所升高,提示白藜芦醇可以缓解肥胖造成的肝脏损伤。段胜红等[12]研究表明,通过每天灌胃100、50、25 mg/kg三个剂量的白藜芦醇,高脂模型SD大鼠血清中的AST和ALT都显著减少(p<0.05),与本试验研究结果一致。Hussein等[13]的研究同样发现,饲喂白藜芦醇能够有效缓解雌性老鼠的肝脏损伤,降低血清中AST和ALT。

2.2.2 白藜芦醇对高脂诱导肥胖小鼠肝脏中LPO、MDA、Cu/Zn-SOD的影响 由表5可知,与LFD组小鼠相比,HFD组小鼠肝脏中LPO和MDA含量分别升高了36.82%和76.25%(p<0.05)。与HFD组小鼠相比,HR组小鼠肝脏中LPO和MDA含量分别显著降低了15.72%和26.95%(p<0.05),以上结果说明,白藜芦醇对肥胖小鼠肝脏脂质过氧化反应起了正调控的作用。

表5 白藜芦醇对高脂诱导肥胖小鼠肝脏中LPO、MDA、Cu/Zn-SOD的影响Table 5 Effect of resveratrol on the activities of lipid peroxidation assay,MDA and Cu/Zn superoxide dismutase in the liver of mice fed with high fat diet

2.2.3 白藜芦醇对高脂诱导肥胖小鼠肝脏糖代谢及能量代谢关键酶及相关基因表达量的影响 由表6可知,与LFD组小鼠相比,HFD组小鼠肝脏中HK、PK、SDH和MDH活力分别降低了15.23%、37.73%、27.28%和16.38%(p<0.05)。在日粮中添加了白藜芦醇,与HFD组小鼠相比,HR组小鼠肝脏中HK、PK、SDH和MDH活力分别升高了34.56%、85.98%、16.04%和18.70%(p<0.05)。以上结果说明,高脂日粮模型会导致小鼠肝脏糖酵解速度减慢,三羧酸循环减弱,白藜芦醇的添加能激活相关酶活性。

表6 白藜芦醇对高脂诱导肥胖小鼠肝脏糖代谢及能量代谢关键酶的影响Table 6 Effect of resveratrol on the glucose metabolism and key enzymes of energy metabolism in the liver of mice fed with high fat diet

由表7可知,与LFD组小鼠相比,HFD组小鼠肝脏中MDH1、Sdha和PGC-1αmRNA相对表达量分别显著降低了15.90%、32.00%和28.2%(p<0.05);在日粮中添加了白藜芦醇,与HFD组小鼠相比,HR组小鼠肝脏中Hk2、Pkm、Cs、MDH1和SdhamRNA相对表达量分别显著升高了94.13%、34.70%、17.99%、41.26%和50.59%(p<0.05),以上结果说明白藜芦醇对肥胖小鼠肝脏糖代谢和能量代谢相关基因表达量影响明显,起了积极作用。

表7 白藜芦醇对高脂诱导肥胖小鼠肝脏代谢相关基因表达量的影响Table 7 Effect of resveratrol on the metabolic related gene expression in the liver of mice fed with high fat diet

肥胖不仅会导致脂代谢紊乱,还会引起糖代谢异常等慢性疾病。HK和PK是糖酵解途径的关键酶,MDH、SDH和CS是三羧酸循环途径的关键酶。在饥饿的条件下,体内HK活性升高,催化葡萄糖生成6-磷酸葡萄糖,6-磷酸葡萄糖在一系列催化作用下生成磷酸烯醇式丙酮酸,在PK的催化作用下生成丙酮酸,从而参与三羧酸循环[16-17]。本实验研究发现,高脂日粮造成小鼠肝脏的HK和PK活性减弱,与Hk2、Pkm mRNA表达量的变化趋势一致,但都差异不显著(p>0.05)。高脂日粮中添加了白藜芦醇以后,小鼠肝脏的HK和PK活性均显著的升高(p<0.05),对应Hk2和Pkm mRNA表达量也显著升高(p<0.05),提示白藜芦醇能够缓解肥胖对糖酵解途径的抑制作用,通过增加脂肪酸的β氧化途径,减少脂肪的生成,从而提高糖酵解作用。Cui等[18]研究表明,饲喂高脂日粮的C57BL/6J小鼠的PGC-1α和Hk2 mRNA表达量著低于低脂日粮组,饲喂木兰提取物BL153这种植物提取物能提高Hk2 mRNA表达量,缓解肥胖造成的肾脏损伤,与本研究结果相似,说明Hk2受到肥胖的影响表达量降低,而植物提取物对其有积极的作用。Wu等[19]研究表明,敲除Hk2,心肝中的活性氧水平显著提高(p<0.05),揭示了能够通过调节线粒体的通透性来减少活性氧的产生,从而缓解心肌肥大,说明Hk2与线粒体代谢有关。本研究通过白藜芦醇调控高脂小鼠Hk2表达量,影响线粒体循环。

SDH是三羧酸循环中第一个脱氢酶,催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸,其活力大小直接反映线粒体三羧酸循环的强弱[20]。MDH存在于线粒体基质中,是三羧酸循环中重要的氧化还原酶,可将草酰乙酸还原成苹果酸,也能催化苹果酸转化为草酰乙酸或者生成丙酮酸,为机体脂肪合成提供了重要的辅酶NADPH[21]。柠檬酸合成酶(citroyl synthetase,CS)催化三羧酸循环中乙酰辅酶A和草酰乙酸缩合成柠檬酸,是调控机体三羧酸循环的又一重要酶[22]。本试验研究发现,由于受到高脂日粮的影响,小鼠肝脏的SDH和MDH活性减弱,MDH1、Sdha和PGC-1αmRNA表达量也显著降低(p<0.05)。高脂日粮中添加了白藜芦醇以后,小鼠肝脏的SDH和MDH活性升高,Cs、MDH1和SdhamRNA表达量也显著升高(p<0.05),提示白藜芦醇能够提高线粒体三羧酸循环活性,缓解肥胖的线粒体损伤。Desquiret-Dumas V 等[23]研究表明,白藜芦醇能够激活肝细胞中线粒体NADH脱氢酶活性,提高NAD/NADH比率,起到调节能量代谢的作用。Ma等[24]研究表明,白藜芦醇能够通过下调HIF-1α的表达,减少线粒体活性氧的产生,从而缓解机体非酒精性脂肪肝,Fang等[25]研究表明,白藜芦醇能够作为SIRT1的激动剂,通过提高SIRT1的活性,增加PGC-1α的去乙酰化来提高线粒体功能,从而改善糖尿病高糖引起的心肌氧化应激,线粒体功能障碍和心肌纤维化。上述研究与本文研究类似,提示白藜芦醇能够通过提高线粒体相关代谢酶活性、调控膜通透性减少活性氧产生等途径来调控肥胖小鼠肝脏损伤。

3 结论

本研究结果表明,高脂日粮模型提高了血清中AST、ALT,增加了肝脏中LPO、MDA的含量,减少了肝脏中SOD、HK、PK、SDH和MDH的活力,相应的mRNA表达量也发生了一致的变化,对机体造成了损伤,引发代谢紊乱。添加了0.04%的白藜芦醇后,相对应的指标均得到了一定程度的改善。以上结果表明:白藜芦醇作为食品添加剂,能够缓解高脂日粮造成的脂质代谢损伤、糖酵解损伤及三羧酸循环损伤。本研究进一步丰富了白藜芦醇调控机体代谢方面的积极作用,也为调控机体饮食肥胖提供了新的思路和实验依据。