罗幸玲,郑 涵,洪佳佳,王 梅,周之荣

(广东药科大学公共卫生学院,广东广州 510310)

近年来,塑料由于具有良好的性能和低成本被广泛用作食品包装材料,但其使用安全性问题也成为研究热点[1-2]。苯酚作为塑料制作的化工原料之一,具有高毒性,因此苯酚的浸出所带来的安全性问题不容忽视[3-4]。食品包装材料的原材料种类多,基质复杂,且苯酚的浸出量常在痕量水平,这为苯酚的测定带来了一定的困难。因此,尽管现有仪器分析方法具有较高的灵敏度,在上机检测前仍需对样品进行净化、分离、富集处理。

快速协同浊点萃取(Rapid synergistic cloud point extraction,RS-CPE)是在传统浊点萃取基础上,通过加入浊点的诱导协同剂,室温下即可完成萃取的一种快速有效分离富集方法。该方法既保留了传统浊点萃取成本低、绿色环保、萃取效果好、易与多种分析仪器联用等优点,又省去了耗时较长的水浴过程,前处理更为简单、省时。诱导协同剂还可辅助表面活性剂萃取目标物,提高萃取率。RS-CPE最早由Wen在2011年提出,与分光光度法联用测定食品和水样中痕量铜[5]。目前,RS-CPE已与原子吸收光谱、电感耦合等离子体发射光谱法等结合用于各种金属离子的测定[6-9],尚未见RS-CPE应用于苯酚分离富集的报道。荧光分光光度法作为测定苯酚常用的分析手段,具有仪器操作简单、运行成本低、抗干扰能力强、灵敏度高(通常比紫外分光光度法高2～3个数量级)等优点。且经RS-CPE所得的富集相可直接转移至比色皿中进行检测,省去了稀释过滤步骤,进一步简化了实验操作。因此,荧光分光光度法与RS-CPE联用用于苯酚测定是较优的选择。然而目前已报道的RS-CPE法中,选用的表面活性剂为Triton X系列,含有苯环结构,会对用荧光分光光度法测定苯酚带来较大的荧光干扰信号。在现有的CPE与荧光分光光度法联用的文献报道中[10],通过扣除Triton X-100空白值对测量值进行校正,导致实验误差较大,特别在苯酚含量低时,严重影响方法灵敏度和准确度。因此,亟需寻找一种对苯酚测定无干扰且萃取效果好的表面活性剂。

聚乙二醇 6000(PEG 6000)作为一种直链型的非离子型表面活性剂,具有无毒、来源广、成本低、无苯环结构、不产生荧光干扰信号、易降解、对环境友好等优点,现已被逐渐应用于浊点萃取中[11]。Samaddar选取PEG 6000作萃取剂,用于汞的形态分析[12];Ulusoy使用PEG 6000萃取食品中的维生素B9,获得良好效果[13]。但是由于PEG 6000的浊点温度高(100 ℃),实验中常需要通过大量电解质的使用和耗时较长的高温水浴条件才能产生浊点现象。然而温度是影响荧光强度的一个重要因素,当随着温度的上升,分子的内部能量转换作用以及分子间的碰撞几率增加,荧光强度减弱。而且过高的水浴温度,也易导致半挥发性苯酚的损失,影响结果的准确性和重现性。目前,PEG 6000尚未应用于苯酚的预富集。

本文选用直链型的非离子表面活性剂PEG 6000为萃取剂,正辛醇为浊点的诱导协同剂,以苯酚的荧光强度为检验指标,考察了聚乙二醇 6000、无水硫酸钠和正辛醇的用量、溶液pH等因素对其的影响,建立了RS-CPE-荧光分光光度法联用测定5种食品塑料包装材料中浸出苯酚的分析方法,为食品塑料包装材料中苯酚的测定提供一种简单、快速、基质干扰少、灵敏度高、廉价的新方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

苯酚标准品 纯度大于99%,德国Dr. Ehrenstorfer公司;PEG 6000 美国Sigma公司;5种食品塑料瓶 从本地超市购买5种聚对苯二甲酸类(PET)不同牌子的饮料瓶,用自来水和超纯水进行清洗,自然干燥,备用;实验试剂 均为分析纯及以上;实验用水 为超纯水(电阻率18.2 mΩ·cm);实验所用器皿 均用10%(v/v)硝酸和10%(v/v)乙醇的溶液浸泡过夜,再用自来水和纯水冲洗干净,并晾干后使用。

F-2500荧光分光光度计 日本日立高新技术公司;TG12Y台式加热离心机 湖南湘立科学仪器有限公司;PHS-3C精密级数字式酸度计 上海虹益仪器仪表有限公司;QB-228台式摇匀机 海门Kylin-bell实验室仪器有限公司;CPA225D型十万分之一电子天平 北京赛多利斯科学仪器有限公司;Synergy超纯水系统 默克密理博公司。

1.2 实验方法

1.2.1 苯酚检测波长的确定 移取一定量的苯酚标准溶液,用纯甲醇稀释定容后,用1 cm石英比色皿装待测溶液,并放入荧光分光光度计,激发和发射狭缝均为5 nm,光电倍增管负高压400 V,扫描速度1500 nm/min,固定激发波长为275 nm,在波长为280～400 nm范围内扫描，获得发射光谱;固定发射波长为300 nm,在波长为240～290 nm范围内扫描,获得激发光谱。光谱图中最大荧光强度对应的激发波长和发射波长选作苯酚的检测波长。

1.2.2 样品预处理 参照相关文献[14-15],在已洗净干燥的塑料瓶中注入超纯水,在60 ℃恒温水浴箱中水浴2 h,获得待检样品的浸泡液。

1.2.3 RS-CPE和荧光分光光度计检测条件 取25.0 μL 1.00 mg/mL的苯酚标准溶液于50 mL离心管中,依次加入8.0 mL 0.2 g/mL PEG 6000,3.0 g无水硫酸钠,5.0 mL正辛醇,2.0 mL pH6.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液,用超纯水定容。充分振荡混匀后,3500 r/min离心3 min。分相后,直接转移富集相至1 cm石英比色皿中,在激发波长/发射波长(λex/λem)=275/300 nm条件下测定其荧光强度。

1.2.4 RS-CPE条件的单因素实验 在λex/λem=275/300 nm的最佳检测波长条件下,固定其他条件不变(溶液pH6.0,8.0 mL 0.2 g/mL PEG 6000,5.0 mL正辛醇,3.0 g无水硫酸钠),采用单因素实验法分别考察了pH(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)、0.2 g/mL PEG 6000添加量(5、6、7、8、9 mL)、正辛醇添加量(4、5、6、7、8 mL)、无水硫酸钠添加量(0、1、2、3、4 g)对苯酚荧光强度的影响,每个实验重复3次。

1.2.5 方法的分析特征实验 分别加入1、2.5、5、10、25、50、75、80 μL 1.00 mg/mL的苯酚标准溶液于50 mL离心管中,用1.2.3的条件进行萃取和检测。以苯酚的质量浓度(ρ,μg/mL)为横坐标,荧光强度(F)为纵坐标绘制标准曲线,获得方法的线性回归方程和相关系数。对10份苯酚空白溶液按照1.2.3的条件进行萃取测定,计算测定值的3倍标准偏差(s)与标准曲线斜率(k)的比值(3s/k),获得方法的检出限(LOD)。对苯酚浓度为0.5 μg/mL的溶液用1.2.3的条件平行萃取测定8次,获得方法的精密度,用相对标准偏差(RSD)表示。

1.2.6 共存离子的干扰实验 按照1.2.3的实验条件,在此基础上分别加入一系列浓度的共存离子,将系列浓度所得的苯酚荧光强度值与不添加干扰离子的荧光强度值进行对比,若测定值间的相对标准偏差在±5%范围内,则定义为不会干扰苯酚的测定。而此浓度与0.5 μg/mL苯酚的比值,则为其浓度倍数关系。

1.2.7 样品分析和加标回收实验 取1.2.2中的样品浸泡液25.0 mL于50 mL离心管中，用1.2.3的条件进行萃取检测。同时,向样品中分别加入两个浓度(0.02、0.20 μg/mL)的苯酚标液,按照1.2.3实验条件做加标回收实验。

1.2.8 分布系数的计算 HA表示平衡溶液中某化合物的分子形式,A-表示平衡溶液中该化合物的一元离子形式。对于一元弱酸而言,在溶液中主要存在HA和A-两种形式,故其分子形式的分布系数δ(HA)=[H+]/{[H+]+Ka},其中[H+]=10-pH;Ka=10-pKa;离子形式的分布系数δ(A-)=Ka/{[H+]+Ka}=1-δ(HA)。

1.3 数据处理

使用Excel 2003对实验数据进行处理,实验结果以测定平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 苯酚检测波长的确定

激发光谱和发射光谱是荧光物质的特征光谱,而最佳激发波长和发射波长是荧光强度最大时的波长,可作为定性和定量分析的依据,也能够有效提高检测灵敏度和选择性。通过扫描苯酚溶液的激发光谱和发射光谱,确定检测的最佳激发波长为275 nm,发射波长为300 nm,结果见图1。

图1 苯酚光谱图 Fig.1 Fluorescence spectra of phenol

2.2 pH对苯酚荧光强度的影响

苯酚的荧光强度随着pH增大，先逐渐升高后呈下降趋势(见图2)。苯酚在溶液中主要以C6H5OH(HA)和C6H5O-(A-)两种形态存在。据报道,苯酚以离子状态存在时不产生荧光,只有中性形式才能产生荧光[10]。苯酚的pKa为9.89,属于一元弱酸物质,故根据1.3公式可以计算出在不同pH溶液中苯酚的不同存在形式所占的比例,从而得出分布系数δ与溶液pH间的关系曲线(图3)。当pH小于9.89(pHpKa),苯酚以离子A-形式存在为主。以HA中性形式存在的苯酚,不仅有较强的荧光信号,而且疏水性能较好,有利于被萃取到疏水的胶束相中,从而获得较高的萃取率。反之,离子状态的苯酚,荧光强度低,且因其亲水性增加,而较难被表面活性剂萃取。但是当pH过低时,会影响胶束相的形成。因此,本研究选择pH6.0做后续的研究条件。

图2 pH对荧光强度的影响 Fig.2 The effect of pH on the fluorescene intensity

图3 苯酚分布系数图 Fig.3 The distribution coefficient diagram of phenol

2.3 表面活性剂添加量对苯酚荧光强度的影响

筛选合适的表面活性剂是实现RS-CPE与荧光分光光度法联用测定苯酚的关键所在。在预实验中,本研究选取了两种直链型的非离子表面活性剂PEG 6000和Tergitol 15-S-7作RS-CPE萃取剂。结果表明,两者在本研究检测波长范围内均无任何荧光信号,故避免了富集相中表面活性剂荧光干扰信号的问题,提高了方法的灵敏度和准确度,使结果更加可靠。两者在水溶液中均可形成胶束,将苯酚萃取至富集相中,但PEG 6000所得的荧光强度高于Tergitol 15-S-7。故本研究选择PEG 6000作为萃取剂,并考察了不同用量的0.2 g/mL PEG 6000对苯酚荧光强度的影响,结果如图4所示。苯酚荧光强度随着0.2 g/mL PEG 6000用量的增大而增大,当使用体积为8.0 mL时,荧光强度达到峰值,随后有轻微下降趋势。这是因为，使用少量萃取剂时,形成的胶束数较少,对目标物的萃取效果差,所得的荧光强度小;但若使用过量的萃取剂,则会使富集相体积增大明显,目标物被过度稀释,从而导致荧光强度有所下降。因此,为确保有足够的表面活性剂形成胶束萃取目标物,本研究选择8.0 mL 0.2 g/mL PEG 6000用于后续实验。

图4 0.2 g/mL PEG 6000对荧光强度的影响 Fig.4 The effect of 0.2 g/mL PEG 6000 on the fluorescence intensity

2.4 正辛醇添加量对苯酚荧光强度的影响

经预实验发现,在甲醇、无水乙醇、正辛醇协同萃取剂中,正辛醇效果最好,使用少量即可将浊点温度降至室温,快速完成萃取过程,故进一步考察了正辛醇用量对苯酚荧光强度的影响,结果见图5。正辛醇用量在4.0～5.0 mL时,苯酚的荧光强度逐渐增大,当用量大于5.0 mL时,苯酚的荧光强度相对稳定。这是因为,一方面使用较少量的正辛醇时,不足以将全部表面活性剂的浊点降至室温,形成的胶束少,这与Wen等人的研究结果是一致的[5]。另一方面,正辛醇可辅助表面活性剂萃取目标物至富集相中,因此随着其用量的增加,苯酚的荧光强度也逐渐增大。故本研究选择正辛醇的最优用量为5.0 mL。

图5 正辛醇对荧光强度的影响 Fig.5 The effect of octanol on the fluorescence intensity

2.5 电解质对苯酚荧光强度的影响

在RS-CPE过程中加入适量的无机电解质，可以改变溶液的浊点温度,促使表面活性剂聚集成更大的胶团,促进分相[16]。实验中观察到,在本研究考察的四种常用无机电解质中,需要使用5.3 g氯化钠方能达到与其他三种盐一样的盐析效果;但是由于碳酸钠和磷酸钠是强碱弱酸盐,其水溶液呈强碱性,由2.2可知,苯酚在碱性条件下主要以离子A-形式存在,导致萃取效率低,荧光强度弱。氯化钠和硫酸钠为中性盐,它们的加入不影响溶液pH。而且相同物质的量浓度的电解质,单电荷离子在水中的电荷密度比多电荷离子低,打断PEG 6000与水的作用力的能力弱,萃取率低[12]。结果表明,无水硫酸钠的使用量少,萃取效果最好,更适用于本实验。从图6可知,荧光强度随无水硫酸钠量的增加而增加,当加入的无水硫酸钠质量为3.0 g时,苯酚的荧光强度达到最大。因此选择加入3.0 g无水硫酸钠。

图6 电解质对荧光强度的影响 Fig.6 The effect of electrolyte on the fluorescence intensity

2.6 方法的分析特征

在上述的最优实验条件下,即溶液pH6.0,8.0 mL 0.2 g/mL PEG 6000,5.0 mL正辛醇,3.0 g无水硫酸钠,进行了方法的分析特征实验。在0.02～1.60 μg/mL范围内,RS-CPE法萃取苯酚的线性回归方程为F=5675.6ρ-2.0598,R2为0.9998,检出限为0.0064 μg/mL,相对标准偏差为4.49%(n=8),表明该方法线性关系良好,灵敏度高,重现性高,精密度好。在最优实验条件下,按被萃取进入富集相的苯酚的量与总量的百分比，计算得出苯酚的萃取率为89.8%,表明该方法的萃取效果佳。

2.7 共存离子对苯酚荧光强度的影响

图7 共存离子的干扰 Fig.7 The interference test of coexisting ions

2.8 实际样品分析和加标回收实验

为了验证该方法的实际应用性,对本地超市购买5种不同牌子的饮料瓶按1.2.2和1.2.3进行萃取测定,结果见表1。其中在样品2中检测到苯酚浓度为0.0310 μg/mL,但其未超过GB 9685-2016规定食品接触材料及制品中苯酚含量均不得大于3 μg/mL的标准,而其他4种牌子的包装材料则均未检出。向样品中分别加入两个浓度(0.02、0.2 μg/mL)的标液,计算其加标回收率。苯酚的回收率为90.5%～109.5%,表明该方法适用于实际样品中苯酚的分析检测。

表1 样品加标回收率(n=3)Table 1 The recovery of sample(n=3)

3 结论

本研究建立了RS-CPE-荧光分光光度法快速测定食品塑料包装材料中浸出苯酚的方法。在正辛醇与无水硫酸钠的协同作用下,直接将浊点温度高达100 ℃的直链型非离子表面活性剂PEG 6000降至室温,实现快速浊点萃取与相分离,并用荧光分光光度计直接进行测定。该方法具有操作简单、环保安全、灵敏度高、检出限低的特点(LOD=0.0064 μg/mL),在0.02～1.60 μg/mL范围内具有良好的线性(R2=0.9998),精密度好(RSD=4.49%,n=8)。在溶液pH6.0,8.0 mL 0.2 g/mL PEG 6000,5.0 mL正辛醇,3.0 g无水硫酸钠的最优条件下,苯酚的萃取率可达89.8%。通过添加两种浓度(0.02、0.2 μg/mL)作加标回收实验,获得较好的加标回收率(90.5%～109.5%),该方法适用于食品塑料包装材料中浸出苯酚的分析测定。