石长春,肖建明,戚建华,史社强,高 荣,李 剑

(1.陕西省治沙研究所,陕西榆林 719000; 2.陕西榆林毛乌素沙地荒漠生态系统国家定位观测研究站,陕西榆林 719000; 3.榆林市林业科学研究所,陕西榆林 719000; 4.西南林业大学林学院,云南昆明 650224)

文冠果(Xanthocerassorbifolia)为我国北方特有的木本油料植物,是北方重点发展的能源林树种,在干旱半干旱地区大量种植[1]。文冠果种仁含油率高,可榨油用于生产生物柴油,而种皮与种仁的重量相当,但目前尚未被开发利用。

黑色素特指一类结构复杂且多样的酚类或吲哚类大分子色素。它们广泛存在于动植物以及微生物体内,生物活性谱宽,具有抗辐射、光保护、金属螯合、抗氧化、抗菌、免疫促进、抗蛇毒、抗癌等诸多功能[2-4]。黑色素在化妆品、医药、食品等领域均有广泛的应用前景[5]。虽然黑色素可以通过化学合成的方法进行生产,但生物基的天然黑色素由于资源丰富,且具有可再生性和良好的环境兼容性,其安全性一般也较高,因此更受消费者欢迎。大多数生物质中黑色素含量较低或原料成本高,目前生产中仍缺乏开发利用价值高的原料[6]。组成黑色素的单体单元各异,由单体聚合形成黑色素过程中的环境条件也会影响聚合物结构,因此这类色素属于高度非均匀性生物大分子,其准确化学结构尚未可知[6]。植物黑色素通常与蛋白质、糖类等其他生物组分通过化学键结合在一起,碱溶液能水解破坏该键,并使之溶解。因此,通常采用碱溶液来提取,并利用其不溶于酸和常见的有机溶剂及抗强酸水解的性质进行纯化[6-7]。植物黑色素因其原料和本身性质的不同,适宜的提取工艺也有所差异。桂花种皮黑色素可以用pH10.5的稀氨水溶液提取[8],但大多数植物黑色素需要用强碱溶液提取,一般为0.1～1 mol/L的氢氧化钠或氢氧化钾水溶液[6-7,9];桂花种皮黑色素在室温下即可提取出来[8],而从山杏种皮[6]、向日葵籽[7]、花椒籽[9]中提取黑色素则需要加热;一般需要提取1～2次,每次6～24 h[6-9]。此外,超声波和酶法辅助提取植物黑色素近年来亦有报道,虽然一定程度上可以缩短提取时间或增加提取得率,但也增加了生产成本[10-11]。

选择黑色素含量高、资源丰富、价格便宜的原料,可以降低天然黑色素的生产成本,开发利用前景更好。文冠果是我国大规模发展的生物柴油原料树种,潜在资源丰富,届时将产生大量的废弃种皮,若不进行有效的开发利用,不仅对资源造成浪费,还会给环境造成压力。文冠果种皮呈黑色,可能含有黑色素,但目前尚无有关研究报道。本研究试图从文冠果种皮中提取植物黑色素,研究了NaOH浓度、提取温度、提取时间以及液料比对提取效果的影响,并通过紫外-可见光光谱、红外光谱、电子顺磁共振波谱和化学定性分析对其性质进行初步研究。以期将文冠果种皮变废为宝,节约资源,减少排放,提高文冠果加工企业的经济效益。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

文冠果种子 陕西省榆林市林业科学研究所;合成多巴(Dihydroxyphenylalanine,DOPA)黑色素标准品 Sigma公司(美国)产品;其它试剂 均为国产分析纯。

Mini-1240紫外-可见光分光光度仪 日本岛津公司;Thermo Avatar 330型傅里叶红外光谱仪 美国Nicolet公司;JES FA-200型电子顺磁共振分析仪 日本电子公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品预处理 文冠果种子带回实验室后,人工剥取种皮,70 ℃鼓风干燥至恒重,粉碎并过40目分样筛后,于室温下保存备用。

1.2.2 文冠果种皮黑色素的提取 将5.0 g文冠果种皮和一定浓度、一定体积的NaOH水溶液加入锥形瓶中,加盖后置于恒温水浴锅中加热提取一定时间,然后将瓶中物料全部转移至漏斗中的定量滤纸上,用容量瓶承接滤液,用纯水反复冲洗滤渣至滤出液为500 mL。

1.2.3 单因素实验 采用单因素实验设计对提取工艺进行优化,研究NaOH浓度、提取温度、提取时间和液料比对提取效果的影响。考察提取溶剂浓度的实验中,设0.01、0.1、0.5、1.0、2.0 mol/L共5个NaOH浓度,提取温度50 ℃,液料比15∶1 mL/g,提取时间12 h;考察提取温度的实验中,设15、30、40、50、60 ℃共5个温度,NaOH浓度为1 mol/L,液料比15∶1 mL/g,提取时间12 h;考察提取时间的实验中,设3、6、12、24、36 h共5个提取时间,NaOH浓度为1 mol/L,提取温度为50 ℃,液料比15∶1 mL/g;考察液料比的实验中,设5∶1、7.5∶1、10∶1、12.5∶1、20∶1 mL/g共6种比例,NaOH浓度为1 mol/L,50 ℃下提取2次,每次12 h。

1.2.4 提取效果评价 由于不同来源的黑色素结构性质差异很大,没有合适的高纯度的标准品用于黑色素的定量测定,因此这类物质的提取得率常用重量法来计算[6,8-11],或通过对比特定条件下提取液吸光度值的高低对提取工艺的优劣进行评判[7]。将1.2.2中得到的滤渣连同滤纸在70 ℃鼓风干燥至恒重并称量,通过测定提取原料与提取后残渣质量之差，计算黑色素粗提物得率。为了用吸光度法评价提取效果,将1.2.2中收集的滤液混匀并从中取出1 mL加入75 mL水中,调节pH至7并定容至100 mL,测定该溶液在400 nm处吸光度[10]。

1.2.5 文冠果种皮黑色素的纯化 按照单因素实验筛选出的工艺提取,得到文冠果种皮黑色素滤液,用HCl将其调至pH2,静置老化12 h后室温下2200×g离心10 min，收集沉淀,加入10倍于沉淀重量的7 mol/L HCl,在100 ℃下水解2 h,冷却后以10000×g离心10 min,沉淀依次用纯水、乙醇、乙酸乙酯、丙酮洗涤,每种溶剂洗涤3次,真空干燥后得到颗粒状的纯化的文冠果种皮黑色素。

1.2.6 黑色素的定性分析 文冠果种皮黑色素和作为对照品的合成多巴黑色素的定性分析参照相关文献[6]的方法进行,测定内容包括:在水、1 mol/L KOH溶液、二甲基亚砜以及水和乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、苯、正己烷等常见有机溶剂中的溶解性,在酸性水中是否沉淀,能否被NaClO、H2O2氧化褪色,以及多酚定性反应。

1.2.7 黑色素的红外光谱测定 黑色素的红外光谱采用KBr压片法进行测定。

1.2.8 黑色素的电子顺磁共振波谱测定 采用固体进样对文冠果种皮黑色素和合成多巴黑色素的电子顺磁共振波谱进行测定,其操作条件为:X波段,微波频率9.4 GHz,微波功率1 mW,中心磁场337.568 mT,扫描宽度5 mT,调制频率100 kHz,调制宽度0.1 mT,时间常数0.03 s,扫描时间2 min,放大倍数200倍,测定温度为室温,样品管内径3 mm。朗德因子g值用比较法中的双标法测得,以锰标(Mn2+/MgO)为标准样品,标定好g因子后线宽直接从谱图上读出。样品的绝对自由基浓度以二苯代苦味酰肼(DPPH·)为标样,通过比较法测得。

1.2.9 文冠果种皮黑色素色价测定 将水解纯化前和纯化后的文冠果种皮黑色素，以0.1 mol/L NaOH将黑色素溶解成100 mg/L的黑色素溶液,用HCl调节pH至中性后，用纯水继续稀释为20 mg/L的黑色素溶液,以1cm比色皿测定400 nm处的吸光度,其值乘以500例换算为浓度为1%时的吸光度,即为400 nm处的色价。

1.3 数据统计分析

每个提取处理独立重复3次,以其平均值作为实验结果,绘制连线散点图,以标准误为误差线。

2 结果与分析

2.1 NaOH浓度对提取效果的影响

实验结果见图1。从图1中可以看出,粗提物得率和吸光度均随着NaOH浓度的升高而增大,但得率的增加速率表现为先慢后快,而吸光度的增加速率则表现为先快后慢,表现为两条曲线并非平行前进。这可能是因为,在NaOH浓度较低时黑色素溶出较少,而水溶性成分仍能被提取出来,从而导致提出物中杂质比例较高;而当NaOH浓度达到1 mol/L后,继续增加其浓度，导致溶出的杂质增加幅度远大于色素增加幅度,表现为吸光度略有增大而粗提物得率增加幅度较大。综合考虑吸光度和得率两个方面,从文冠果中提取黑色素时，NaOH浓度以1 mol/L为宜。

图1 NaOH浓度对文冠果种皮黑色素 粗提物得率和吸光度的影响Fig.1 Effect of NaOH concentration on yield and absorbance of crude extracts from testae of Xanthoceras sorbifolia

2.2 提取温度对提取效果的影响

温度不仅影响化学提取过程的反应速率,而且影响传质速率和物质的溶解度,是黑色素提取过程中的重要工艺参数。不同提取温度下文冠果种皮黑色素的提取效果如图2所示。由图2可以看出,在本试验所设定的条件下,粗提物得率和吸光度均随温度升高而增大。在15～50 ℃,得率缓慢增大,但继续提高提取温度后粗提物得率急剧增大。这可能是因为,升高温度既有利于黑色素的溶出,也有利于其他杂质的溶出,在温度超过50 ℃后溶出的杂质更多,从而导致吸光度增幅小而粗提物得率增幅大。姚增玉等[6]在对山杏种皮黑色素提取工艺研究中也有类似发现:与40 ℃相比,60 ℃下因大量杂质被提取了出来而使得粗提物得率大幅增加。因此,综合考虑得率和粗提物中杂质含量两个方面,从文冠果种皮中提取黑色素以50 ℃为宜。

图2 提取温度对文冠果种皮黑色素 粗提物得率和吸光度的影响Fig.2 Effects of extraction temperature on yield and absorbance of crude extracts from testae of Xanthoceras sorbifolia

2.3 提取时间对提取效果的影响

图3为不同提取时间下文冠果种皮黑色素粗提物的得率和吸光度。由图3可见,就得率而言,提取时间以24 h为宜。植物黑色素含有丰富的酚羟基,这种官能团在碱性条件下可以被氧化成醌基,颜色加深,摩尔吸光系数增大。反应24 h后，继续延长时间，粗提物得率虽然没有明显增加,但其吸光度却明显增大,可能与黑色素被氧化有关。提取时间不超过12 h时,吸光度和粗提物得率均随着时间的延长快速增加,曲线较陡,此后(12～24 h)吸光度和粗提物得率增速均减慢,曲线较为平缓,也就是说,在12 h内大部分黑色素已被提取出来。为了防止已被萃取至NaOH溶液中的黑色素在后续提取过程(12～24 h)中被氧化,应该先将其过滤出来,更换新的溶剂继续提取12 h。即提取2次,每次12 h,共24 h。

2.4 液料比对提取效果的影响

图4为不同液料比对文冠果种皮黑色素提取效果的影响。从图4可以看出,随着液料比的增大粗提物得率和吸光度均增大,当液料比增至15 mL/g之后,再继续增加液料比，粗提物得率和吸光度几乎不再增大。因此,液料比以15 mL/g为宜。

图4 液料比对文冠果种皮黑色素 粗提物得率和吸光度的影响Fig.4 Effects of liquid/solid ratio on yield and absorbance of crude extracts from testae of Xanthoceras sorbifolia

综合以上结果,单因素实验优化后的提取条件为:1 mol/L NaOH为溶剂,液料比为15 mL/g,在50 ℃下提取2次,每次12 h。为了确定其提取效果,在此工艺条件下进行实验,并将得到的黑色素粗提物进一步通过酸水解和有机溶剂洗涤的方法进行纯化,结果为黑色素粗提物得率为14.42%±0.76%,纯化黑色素得率为5.23%±0.24%(以文冠果种皮质量为基),纯化前黑色素粗提物400 nm处的色价为423±8,而纯化后提高至512±6。纯化后粗提物中黑色素得率下降了63.7%,而色价仅增加了21.0%。这可能是因为,在加入盐酸将黑色素从碱性的提取液中沉淀回收时,上清液仍然有很浓的颜色,导致一部分色素没有被回收。这部分色素不具有不溶于酸、水以及乙醇的典型黑色素性质,属于分子量比较小的黑色素[12]。虽然常常因不典型而未被计入黑色素,但因其有更好的溶解性和更强的抗氧化能力,其应用范围更广,具有比较好的开发利用潜力[3,12]。因此在能够满足纯度要求且无副作用的情况下,可直接利用文冠果种皮黑色素粗提液,以充分利用这部分非典型黑色素。

2.5 文冠果种皮黑色素的结构及理化性质

本研究是对文冠果种皮黑色素的首次报道。因此,在对其提取工艺进行优化的基础上,进一步通过紫外-可见光光谱、红外光谱、电子顺磁共振波谱和定性分析对其结构及理化性质进行研究。

2.5.1 文冠果种皮黑色素的紫外-可见光光谱分析 文冠果种皮黑色素和作为对照品的人工合成多巴黑色素的紫外-可见光光谱扫描结果如图5所示。二者都是在200～800 nm的扫描范围内，随波长增大而吸光度减小,没有明显的吸收峰,类似现象在对山杏种皮黑色素的研究中也有报道[6]。但与合成黑色素相比,文冠果种皮黑色素以及山杏种皮黑色素都在270～280 nm处有一肩峰,这一肩峰是由水解后残留于黑色素上的结合蛋白质中的芳族氨基酸(酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸)残基对紫外光的吸收所引起的[6]。黑色素吸光度的对数对波长回归得到斜率为负值的直线,这是黑色素的紫外-可见光光谱的重要特征之一,常用作对黑色素的定性鉴定[6,13]。文冠果种皮黑色素的该回归直线斜率为-0.0038,合成多巴黑色素的回归直线斜率为-0.0033,山杏种皮黑色素的回归直线斜率为-0.0039[6]。

图5 文冠果种皮黑色素的紫外-可见光谱Fig.5 UV-Vis spectrum of melanin from testae of Xanthoceras sorbifolia

2.5.2 文冠果种皮黑色素的红外光谱分析 黑色素结构非常复杂,现有技术还无法给出其明确结构,且不同来源的黑色素结构差异很大,红外光谱可以给出黑色素结构中主要官能团的信息,是黑色素结构表征中重要的研究方法之一。本研究采用KBr压片法对文冠果种皮黑色素和人工合成DOPA黑色素的红外光谱进行测定,其谱图如图6所示。从图6中可以看出,两种黑色素的红外光谱非常相似,特征峰所处位置较为接近,说明二者的主要官能团基本一致。在3400 cm-1附近都存在强而宽的吸收峰,是由-OH和-NH2的伸缩振动产生的[13];在1650～1620 cm-1有一强的吸收带,是由芳香C=C、酰胺I中的C=O和(或)COO-的振动引起的,而1450～1440 cm-1的吸收带为芳环骨架振动所致,说明分子骨架中含有大量芳环[13-14]。人工合成多巴黑色素在1720～1710 cm-1处有一弱的吸收带,这是由许多含C=O的官能团的伸缩振动引起的[14-15]。文冠果种皮黑色素这一吸收带的缺失可能是由于含C=O的官能团参与了氢键形成,并部分形成了COO-[14]。文冠果种皮黑色素还在1510 cm-1附近有一弱的吸收带为酰胺II带[14-15]。

图6 文冠果种皮黑色素与合成多巴黑色素的红外光谱Fig.6 FT-IR spectrum of melanin from testae of Xanthoceras sorbifolia and synthetic DOPA-melanin

2.5.3 文冠果种皮黑色素的电子顺磁共振波谱分析 文冠果种皮黑色素和人工合成多巴黑色素的电子顺磁共振波谱(EPR)非常相似,都是典型的单线一次微商波谱,未检测到超精细结构(图7)。测得的文冠果种皮黑色素和人工合成多巴黑色素EPR参数列于表1。有机自由基的g-因子值可用于研究自由基结构及其周围环境。半醌自由基的g-值一般处于2.0038～2.0048之间[15]。从表1可以看出,文冠果种皮黑色素的g-因子值与合成DOPA黑色素非常接近,其顺磁性均来源于半醌自由基。文冠果种皮黑色素的线宽(ΔHpp)略大于DOPA黑色素,可能是前者中的自由基相对缺少保护,从而与相邻自由基产生相互作用,进而导致松弛时间缩短,具体表现为线宽增大。合成多巴黑色素自由基浓度比文冠果种皮黑色素高出1个数量级,可能是由于天然黑色素属于非均一性物质,其单体单元复杂多样,有些单体不产生自由基或产生自由基的浓度相对较低,导致所聚合成的黑色素的电子自旋密度降低。此外天然黑色素很难通过精制纯化达到如天然合成黑色素一样的纯度,因此顺磁性较弱。

图7 文冠果种皮黑色素与合成多巴 黑色素的电子顺磁共振波谱Fig.7 Electron paramagnetic resonance spectrum of melanin from testae of Xanthoceras sorbifolia and synthetic DOPA-melanin

表1 文冠果种皮黑色素与合成多巴黑色素的顺磁共振参数Table 1 ESR spectral parameters of melanin from testae of Xanthoceras sorbifolia and synthetic DOPA-melanin

2.5.4 文冠果种皮黑色素的定性分析 文冠果种皮黑色素与山杏种皮黑色素以及人工合成多巴黑色素的性质比较结果见表2。文冠果种皮黑色素的理化性质与人工合成多巴黑色素以及其他天然黑色素[5]非常相似,不溶于水和乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、苯、正己烷等常见的有机溶剂,溶于碱溶液,在酸性溶液中或遇FeCl3后产生沉淀,可被H2O2和NaClO等强氧化剂漂白,具有多酚的性质。从表2中可以看出,它们的不同之处在于酸性溶液中沉淀的pH以及氧化漂白所需时间不同,山杏种皮黑色素在pH小于4时即发生沉淀,而文冠果种皮黑色素与合成多巴黑色素相似,在pH<3时才出现沉淀;文冠果种皮黑色素在被NaClO漂白的耐受性方面也与人工合成黑色素相近,均需3 h达到完全褪色,而山杏种皮黑色素2 h即完全褪色;双氧水完全漂白三种黑色素所需的时间各不相同,合成黑色素最为敏感,2 h即被完全漂白,而文冠果种皮黑色素和山杏种皮黑色素所需时间则分别为24、36 h。类似现象也曾有报道:儿茶酚黑色素、多巴黑色素和二羟基萘黑色素等不同类型的黑色素漂白时间差异很大[16]。Harki等[13]认为,黑色素氧化漂白反应速率的不同是其结构内在差异的外在反映。

表2 文冠果种皮黑色素与其他黑色素的比较Table 2 Diagnostic tests for melanin from testae of Xanthoceras sorbifolia with other melanins

3 结论与讨论

本研究首次从文冠果种皮中提取得到了黑色素,该黑色素适宜于用1 mol/L NaOH 在50 ℃下提取2次,每次12 h,液料比以15 mL/g为宜。在此工艺条件下黑色素粗提物得率为14.42%,进一步经酸水解和有机溶剂洗涤纯化,最终纯化黑色素的得率约为5.23%。文冠果种皮黑色素具有黑色素典型的性质:不溶于水和一般的有机溶剂,在1 mol/L KOH溶液中完全溶解,pH<3时发生沉淀,可被NaClO和H2O2氧化漂白,多酚定性反应呈阳性;在紫外-可见光区没有吸收峰,红外光谱中在3400 cm-1附近和1650～1620 cm-1各有一个强的吸收带,顺磁共振波谱为典型的单线一次微商波谱,无超精细结构。

多数植物材料中黑色素的含量较低,仅有0.2%～0.3%[9],个别材料可达6%～8%[17]。文冠果种皮呈黑色,从中提取黑色素得率为5.23%,属于富含黑色素的植物材料,其中的黑色素资源具有很高的开发利用潜力。黑色素的性质因来源而异,适宜的提取条件也不尽相同,本研究对其提取工艺进行了优化,并采用紫外-可见光光谱、红外光谱、电子顺磁共振以及定性分析对结构及其理化性质进行了较为系统的分析表征,研究结果可为文冠果种皮黑色素资源的开发利用提供技术参考和理论支撑。