陈 政,穆利霞,廖森泰,*,邹宇晓

(1.华中农业大学食品科技学院,湖北武汉 430070; 2.广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所,广东广州 510610)

蚕蛹是蚕蛾科家蚕蛾的蛹,也是蚕茧缫丝后的主要副产物。长期以来,我国人民一直把它当作滋补强生,健脾和胃,增长肌肉,祛风除湿的药食佳品[1]。蚕蛹富含蛋白质,其干物质粗蛋白含量在52%以上,蛋白质中含有18种氨基酸,所含氨基酸配比均衡性好(必需氨基酸∶非必需氨基酸=0.7∶1),且必需氨基酸接近或超过总氨基酸的40%[2],符合FAO/WHO所建议的理想氨基酸模式(必需氨基酸占总氨基酸含量的40%,且必需氨基酸∶非必需氨基酸=0.6∶1),是一种优质的昆虫类蛋白资源,也是受到卫生部认可并批准的“作为普通食品管理的食品新资源名单”中唯一的昆虫类食品[3]。

目前,市场上的蚕蛹类相关产品主要包括即食蚕蛹、蚕蛹油、蚕蛹蛋白粉、蚕蛹酱油、氨基酸口服液等,但这些产品往往技术含量不高,无显著的保健功能或者缺少产品的更新换代,因此并没能在市场上占得一席之地,从而造成蚕蛹蛋白资源不能得到广泛利用[4]。科研人员对蚕蛹等昆虫类蛋白的研究主要集中在对其营养功能的分析和讨论,或基于蛋白质的物理或者化学改性、活性肽的提取、水解氨基酸的制备,及蚕蛹蛋白粉的蚕蛹多肽的制备[5]。郑仕远[6]利用蛋白改性的原理,研究蚕蛹蛋白的酶解工艺,发现经前处理(脱脂、脱纤维)和改性后的蚕蛹蛋白的酶解效率得到了改善。肖燕平等[7]发现蚕蛹蛋白酶解产物具有很强的体外抗氧化活性。昌友权等[8]指出蚕蛹蛋白对体细胞有显著的免疫作用。宋莲军等[9]将脱脂后的蚕蛹进行水解,得到的酶解产物水解度达23.75%,水解液中18种氨基酸的浓度达15.64 g/L。鲁珍等[10]研究发现,蚕蛹来源丰富,蛋白质和鲜甜味氨基酸含量高,是制备呈味基料的优质原料,利用蚕蛹制备呈味基料可以大大提高蚕蛹的利用价值。蚕蛹虽然蛋白含量高,但蚕蛹因其蛋白生产技术的不足、腥臭味残留及市场推广等问题,限制了它在食品、工业、医药等方面的应用。

针对蚕蛹制作的美拉德反应产物存在风味单一,香气不够浓郁,苦味和腥臭味较重等问题,本研究分别以新鲜削茧桑蚕蛹和柞蚕蛹为原料,通过脂肪酶的预处理和鸡油的添加对桑蚕蛹和柞蚕蛹进行处理,通过酶解和美拉德反应制备呈味基料,以酶解产物的水解度、呈味基料的氨基酸组成、感官风味等为评价指标,旨在探讨不同处理对蚕蛹制备呈味基料风味的综合影响,为蚕蛹的呈味基料的制备和高值化利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜剥茧桑蚕蛹 产地广西,呈土黄色,身长2～4 cm,单个重量2～4 g,鲜重蛋白含量12.83%;新鲜剥茧柞蚕蛹 产地黑龙江,呈黑褐色,身长4～6 cm,单个重量12～16 g,鲜重蛋白含量16.36%;鸡油 购于广州黄沙海鲜市场;Novozym 37071(20.35×104U/g)、风味蛋白酶(1.88×104U/g) 诺维信(中国)生物技术有限公司;脂肪酶(3.00×104U/g) 广州市齐云生物技术有限公司;L-半胱氨酸盐酸盐、硫胺素、D-木糖 上海伯奥生物科技有限公司;其他试剂均为分析纯。

K8400凯氏定氮仪 瑞典FOSS 公司;PB-10 pH计 瑞士Mettler Toledo公司;DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 巩义市予华仪器有限责任公司;YXQ-LS-30SII立式压力蒸汽灭菌器 上海博讯实业有限公司医疗设备厂;Biofuge Stratos Sorvall离心机 美国Thermo公司;L-8900 氨基酸分析仪 日本HITACHI公司;6890 N/5975气质联用仪 美国Agilent公司;75 μm(Carboxen/PDMS)萃取头 美国Agilent公司;Supelco手动固相微萃取进样手柄 美国Agilent公司。

1.2 实验方法

1.2.1 蚕蛹处理方式 漂烫灭酶:将桑蚕蛹和柞蚕蛹分别用沸水浴漂烫2 min;用榨汁机将灭酶后的蚕蛹打成浆,测定其蛋白含量:参照GB5009.5-2016。

1.2.2 脂肪酶的预处理 测得桑蚕蛹蛋白含量后,分别用蒸馏水将柞蚕蛹底物蛋白浓度调至10%(m/v),参照吴婕[11]的方法并加以改进,于50 ℃水浴中搅拌40 min,用0.5 mol/L的NaOH溶液将pH调节至8.0,一杯加入占溶液质量2.7%的脂肪酶,另一杯不加脂肪酶作为空白对照,控制温度为45 ℃,水解2 h。

测得柞蚕蛹蛋白含量后,用蒸馏水将柞蚕蛹底物蛋白浓度调至10%(m/v),于50 ℃水浴中搅拌40 min,用0.5 mol/L的NaOH溶液将pH调节至8.0,一杯加入占溶液质量2.7%的脂肪酶,另一杯不加脂肪酶作为空白对照,控制温度为45 ℃,水解2 h。

1.2.3 蚕蛹蛋白酶解液的制备 待上述4组样品经脂肪酶水解2 h后,用0.5 mol/L的NaOH溶液将pH调节至8.0,加入占样品蛋白质量5.4%的风味蛋白酶、2.3%的Novozym 37071,控制温度为50 ℃,开始酶解,6 h后于沸水浴中灭酶10 min,过滤得蚕蛹酶解液。

1.2.4 水解度的测定 水解度(DH)测定:pH-stat法[12]。

1.2.5 鸡油的添加及美拉德反应产物的制备 将上述4组样品各均分2份,一份添加2%的鸡油,另一份不添加作为空白对照,得到八组样品:蚕蛹不加脂肪酶不加鸡油(SC),桑蚕酶不加脂肪酶加鸡油(COSC),桑蚕蛹脂肪酶预处理不加鸡油(LSC),桑蚕蛹脂肪酶预处理加鸡油(LCOSC),柞蚕蛹不加脂肪酶不加鸡油(OSC),柞蚕蛹不加脂肪酶加鸡油(COOSC),柞蚕蛹脂肪酶预处理不加鸡油(LOSC),柞蚕蛹脂肪酶预处理加鸡油(LCOOSC)。参照鲁珍等[10]的方法并稍作调整进行美拉德反应:酶解液30 mL,D-木糖0.75 g,L-半胱氨酸盐酸盐0.6 g,硫胺素0.45 g,温度110 ℃,时间60 min。

1.2.6 氨基酸的测定 分别检测八组样品的总氨基酸组成及含量,方法参照GB 5009.124-2016。

1.2.7 感官评价 参照吴婕等[11]的方法,对样品从色泽、组织形态、气味和滋味四个方面综合评定并打分。本次实验采用100分制,每项指标25分,每个样品评分数据去掉最高和最低评分后取平均值。感官评定小组由10位品评员组成。感官评价标准见表1。

表1 蚕蛹呈味肽感官评分标准Table 1 Sensory evaluation criterion of silkworm chrysalis

1.2.8 风味物质成分的提取 采用顶空固相微萃取(HS-SPME)的方法,其中萃取头在使用前要老化,以确保脱去其可能吸附的挥发性成分。老化后的萃取头在GC-MS上检测略有极少量的萃取头固有杂质峰出现,在样品质谱库检索的时候去除,不计入最终结果。

固相微萃取的操作步骤:分别量取4 mL样品于顶空萃取瓶中,应用75 μm(Carboxen/PDMS)固相微萃取头(Supelco,Bellefone,PA,USA)在50 ℃条件下萃取30 min富集挥发性化合物,然后用气相色谱来分析纤维头上的挥发性化合物[13]。

1.2.9 风味物质鉴定 色谱条件(GC):J&W 122-7032毛细管柱(30 m×250 μm×0.25 μm);模式:恒定流量;加热器:250 ℃;压力13.06 psi;分流流量:23.3 mL·min-1;升温程序:150 ℃保持5 min,以3 ℃/min升至230 ℃,保持10 min。检测器温度:250 ℃;进样量:0.2 μL;溶剂推迟:2 min;载气(He)流量:40 mL/min;分流比20∶1。

质谱条件(MS):电子轰击(EI)离子源;电子能量70 eV;传输线温度275 ℃;离子源温度200 ℃;母离子m/z 285;激活电压1.5 V;质量扫描范围m/z 30～450。检索谱库为NIST。

1.2.10 数据处理与统计分析 文中每组实验结果均重复3次(感官评价除外),结果以“平均值±标准差”表示,运用Microsoft Excel 2013对实验数据进行整理与制表,Origin 7.5软件(OriginLab公司)作图,SPSS17.0软件(IBM公司)进行显著性分析,p<0.05为显著。挥发性风味物质成分试验数据处理由GC-MS分析软件系统完成,通过检索NIST11质谱库进行定性,未知化合物经计算机检索的同时与标准图谱对照相匹配,匹配度大于80(最大值为100)的作为鉴定结果。物质的相对百分含量按峰面积归一化法计算。

2 结果与分析

2.1 不同处理对蚕蛹酶解液美拉德反应产物感官评价指标的影响

美拉德反应是还原糖和氨基酸、肽或蛋白质之间的非酶反应,也是形成大多数风味化合物的主要途径,可以改善食品的色、香、味[14]。不同处理的美拉德反应产物的感官评价如表2所示,由表2可知,无论是桑蚕蛹还是柞蚕蛹,都是脂肪酶预处理加鸡油组的风味最好,总分最高的是柞蚕蛹脂肪酶预处理加鸡油(81.8)和桑蚕蛹脂肪酶预处理加鸡油(79.1)。总体而言,脂肪酶预处理组与对照组相比,在组织形态和滋味方面存在显著差异(p<0.05),在色泽和气味方面存在显著差异;而添加鸡油组与对照组相比,在滋味方面存在显著差异(p<0.05),在色泽、组织形态和气味方面评分与对照组相差不大;既有脂肪酶预处理又添加鸡油组与对照组相比,在色泽、组织形态、气味和滋味四个方面都存在显著性优势(p<0.05)。综合得分情况,两种处理组>单个处理组>空白对照组。这表明一定量的脂肪酶处理和鸡油的添加都能对蚕蛹呈味肽的感官评价产生积极的影响,而两者共同作用的效果更为明显。

表2 不同处理的美拉德反应产物的感官评价Table 2 Sensory evaluation results of Maillard reaction products

2.2 不同处理对蚕蛹酶解液水解度的影响

水解度是反映蛋白质水解程度的一个重要指标,水解度的不同会引起酶解产物氨基酸组成的差异,从而影响风味物质的形成[15]。脂肪酶预处理与空白对照组的水解度如图1所示,在360 min时,柞蚕蛹加酶的水解度最高(26.21%),依次为:柞蚕蛹加酶(26.21%)>柞蚕不加酶(24.22%)>桑蚕蛹加酶(23.83%)>桑蚕蛹不加酶(22.41%)。在120 min后,脂肪酶预处理组的水解度与对照组相比存在显著性差异(p<0.05),处理组的水解度明显大于对照组。Gustavo L L S等[16]发现,脂肪酶酶解脂肪,使得一部分与脂肪结合的蛋白质基团暴露出来,进一步酶解,使水解度增大。这表明脂肪酶的预处理有助于蚕蛹蛋白水解,使蚕蛹蛋白水解度增大。

图1 不同处理对蚕蛹酶解液水解度的影响Fig.1 Influence of the pupa enzymatic hydrolysis with different methods

2.3 不同处理对美拉德反应氨基酸组成的影响

蛋白质在酶的水解作用下,最终变成小分子的短肽和游离氨基酸,而短肽和游离氨基酸都是参与美拉德反应的重要物质[17]。八种处理方式制备的美拉德反应产物氨基酸组成如表3所示,八种处理中LCOOSC组(柞蚕蛹脂肪酶预处理加鸡油)的鲜甜味氨基酸占总鲜甜味氨基酸的比例最高(45.58%),与对照组OSC组(柞蚕蛹不加脂肪酶酶不加鸡油)相比,鲜甜味氨基酸占总氨基酸的比例显著提高(p<0.05),这与感官评价脂肪酶处理和鸡油添加能显著提高呈味肽风味的结果相一致。类似的,第LCOSC组(桑蚕蛹脂肪酶预处理加鸡油)相比第SC组(桑蚕蛹不加脂肪酶不加鸡油),鲜甜味氨基酸占总氨基酸的比例显著提高(p<0.05)。说明脂肪酶和鸡油共同作用,能使美拉德反应产物的鲜甜味氨基酸占总氨基酸比例显著提高(p<0.05),与前面感官评价结果一致。

表3 不同处理对蚕蛹美拉德反应产物氨基酸组成的影响Table 3 Influence of the amino analysis of MRPS with different methods

2.4 不同处理对蚕蛹酶解液美拉德反应产物挥发性风味物质的影响

蚕蛹美拉德反应产物的风味物质较为复杂,种类颇多,其中最重要的呈味物质是醛、吡嗪、酮、呋喃以及其它化合物。

由脂质氧化、热降解产生的,醛类化合物是肉香成分中的特征化合物之一[18]。8组试验样品鉴定出的醛类化合物中，壬醛和异戊醛含量较高,壬醛具有玫瑰和柑橘芳香,异戊醛则是亮氨酸发生Strecker降解产生的,具有巧克力香味,是咖啡、巧克力、牛奶、鸡肉等食物的关键香气成分之一[19]。低含量的醛可以赋予产品脂香风味。

其次,样品检测到的吡嗪类化合物种类也较多,主要有2-甲基吡1嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,5-二甲基-3-乙基吡嗪。吡嗪类物质是美拉德反应的典型产物,其阈值低,具有坚果香、焦香和基本的烤肉香,是对肉香味形成贡献较大的化合物[20],在检测到的吡嗪类化合物中2,5-二甲基吡嗪和2-乙基-3,6-二甲基吡嗪含量较高,2,5-二甲基吡嗪具有烤香和肉香,2-乙基-3,6-二甲基吡嗪具有坚果香。其中低分子肽(<500Da)是吡嗪类化合物产生的主要贡献者。脱衬模拟处理样品中吡嗪类物质的减少,可能是由于酶解液中肽类氨基酸的减少。Scalone GL[21]等研究发现,寡肽的存在可以显著增加吡嗪类化合物的含量,游离氨基酸对生成吡嗪类物质则贡献较少。

酮类及醇类化合物的呈味阈值较高,因此对风味的贡献不大。酯类呈味阈值低,也是反应产物的主要呈味物质[22],其中乙醇酸乙酯、2-羟乙基甲酸酯及丁酸甲酯的含量较高。呋喃类化合物因其大都具有强烈的肉香及极低的香气阈值,而几乎存在于所有的食品香味中。不同处理样品均检出了2-戊基呋喃,该物质阈值低(4ppb),具有烤味、葱香味,是动物脂质热氧化生成的常见风味物质之一[23]。此外,还检测出了较多的其它挥发性化合物,其中二甲基三硫具有肉香、洋葱和蔬菜香气,且阈值极低[24];十一烷具有杂醇气味,含量很高,但烷烃呈味阈值较高[25],因此推测其对呈味有一定的贡献,但对整体风味贡献不大。

表4 桑蚕蛹美拉德反应产物主要风味成分的种类归属及相对含量Table 4 The kinds of classification and relative percentage of Silkworm pupa Maillard reaction product

表5 柞蚕蛹美拉德反应产物主要风味成分的种类归属及相对含量Table 5 The kinds of classification and relative percentage of Oak Silkworm pupa Maillard reaction product

总体而言,脂肪酶处理组与对照组相比,吡嗪类物质的种类和含量都有所增加,存在显著性差异(p<0.05)。

鸡油添加组与对照组相比,醛类和呋喃类物质的含量有所增加,存在显著性差异(p<0.05)。而脂肪酶处理和鸡油添加组与对照组相比,醛类、吡嗪类、呋喃类风味物质种类和含量都显著性增加(p<0.05),而这三类物质都对呈味肽的风味有积极正面的影响。说明脂肪酶处理和鸡油添加能使蚕蛹呈味肽的主要风味成分显著提高(p<0.05)。

3 结论

脂肪酶预处理和鸡油添加两种处理方式均能在一定程度上改善呈味基料的感官特性,其中柞蚕蛹脂肪酶预处理加鸡油处理的最终产物风味最好,评分为81.8。脂肪酶预处理和鸡油添加共同作用,能使蚕蛹呈味肽中鲜甜味氨基酸占总氨基酸的比例显著提高。其中最高的为第8组(柞蚕蛹脂肪酶预处理加鸡油),鲜甜味氨基酸占总氨基酸的比例为45.58%。脂肪酶处理和鸡油的添加可以显著提高蚕蛹呈味肽中醛类、吡嗪类和呋喃类等主要风味物质的种类和含量,从而提高蚕蛹呈味肽的整体风味。

本文没有涉及蚕蛹脱脂处理的风味研究,有待进一步试验研究蚕蛹脂肪对呈味肽风味的影响。