常燕楠 刘洁 梁金太

【摘 要】 PAL是催化直接脱掉L-苯丙氨酸上的氨而生成反式桂皮酸的酶，是一个可把苯丙氨酸用于酚类化合物合成的酶。本文利用电子克隆技术获得一个马铃薯PAL基因的cDNA序列，运用多种生物信息学方法对其进行初步分析。从核酸序列到氨基酸序列，再到蛋白质的高级结构预测，获得了该基因的电子克隆全长。结果表明：该序列全长2529bp，共编码722个氨基酸，有多个限制性酶切位点，有38个磷酸化位点，属于亲水性氨基酸，无信号肽，无膜穿透性，无保守结构域。文末对下一步的实验验证和功能分析进行了展望，为进一步研究该基因在马铃薯特别是在抗病性的功能提供相关依据。

【关键词】 马铃薯； PAL； 生物信息学

[Abstract] Pal is an enzyme that catalyzes the direct removal of ammonia from L-phenylalanine and the formation of trans-cinnamic acid. It is an enzyme that can use phenylalanine for the synthesis of phenolic compounds. In this paper， the cDNA sequence of a potato pal gene was obtained by using electronic cloning technique， and the cDNA sequence was preliminarily analyzed by various bioinformatics methods. From nucleic acid sequence to amino acid sequence to advanced structure prediction of protein， the full length of electronic clone of this gene was obtained. The results showed that the sequence was 2529bp， encoding 722 amino acids， with multiple restriction endonuclease sites and 38 phosphorylation sites， which was hydrophilic. Amino acids， no signal peptide， no membrane penetration， no conserved domain. At the end of the paper， the future experimental verification and functional analysis were prospected， which provided the relevant basis for further study of the function of the gene in potato， especially in resistance to disease.

[Keywords] potato； pal； Bioinformatics

1961年苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase， PAL）首次在绿色植物中被发现。随着更加深入的研究，该酶已逐步被固定化，并且已经用于工业化生产苯丙氨酸[1]。苯丙素类生物合成（又称一般苯丙氨酸途径）需要一系列核心酶调控，PAL是一般苯丙氨酸途径的切入点酶，它将L-苯丙氨酸（L-Phe）从初级代谢反应引入到反式肉桂酸（t-CA））的合成过程中[2]。生成的t-CA被进一步转化为许多种芳香族化合物，统称为聚酚类化合物，在植物中已鉴定出8000多种芳香族代谢物，包括苯烯类化合物、香豆素、黄酮、黄酮醇、二苯乙烯、羟基肉桂酸盐、木质素和大分子木质素。这个大型芳香化合物家族实现了许多对植物生长，发育和植物与环境相互作用至关重要的生理功能[3]。

PAL在植物生理代謝方面具有重要意义，比如木质素是细胞次生壁的一种结构成分，它给植物细胞提供机械支持，并产生了一个疏水性环境，这对于植物传导水分和养分十分重要[4]。黄酮类和花青素类物质这些聚酚类化合物可作为抗病原性植物抗毒素剂、抗氧化剂直接保护植物免受生物和非生物胁迫，或作为介导植物与微生物相互作用的信号分子。同时，经该途径产生的黄酮类化合物被发现与植物根瘤菌有趋化作用，有些类黄酮化合物还可以诱导根瘤菌结瘤基因[1]。

研究发现，许多植物在严寒、机械损伤、病原菌微生物感染等逆境条件下，植物的苯丙素类代谢被迅速激活，PAL活性迅速上升。PAL活性可作为一个生理指标以指示植物的抗逆能力[5]。现已发现PAL参与提高植物抗病性的化合物的合成，比如植保素、木质素和酚类物质等。PAL已被证实可以间接参与植物抗虫性，比如苯丙素类代谢途径的产物之一木质素使植物细胞壁加厚，木质化程度增加，对食草类动物形成一道机械障碍。草食性昆虫在取食植物时会受到苯丙素类代谢途径的另一代谢产物植保素地毒害作用和趋避作用[1]。因此，研究植物苯丙素类生物合成及其调控机制具有重要的现实意义和实际应用价值。

马铃薯（Solanum tuberosum L.）是全球四大粮食作物之一，在一定程度上可以保障我国的粮食安全[6]，2015年，农业部提出我国马铃薯主食化战略，为国家粮食安全提供更多保障[7]。马铃薯青枯病是马铃薯第二大病害，严重威胁马铃薯品质和产量[8]。段江燕等发现，PAL 活性可以作为青枯菌侵染马铃薯的生理生化指标[9]。

本实验室在马铃薯与青枯菌互作过程中提取出来的一条EST，经过NCBI 碱基同源性BLAST初步分析，判断这条EST是马铃薯PAL（phenylalanine ammonia-lyase-like（LOC102596017）， mRNA）基因，并推断它参与马铃薯青枯病的抗性，本文利用相关的软件及在线服务器对该EST进行一系列生物信息学分析，以期能为其后续功能研究及实际应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 PAL基因的电子克隆

以本实验室前期获得的一条EST为探针，在NCBI的Genbank库中通過Blastn搜寻同源序列，在检索结果中选取 1 条 Query cover 高、E 值低的序列作为subject序列，通过用Bioedit软件将subject序列与原始Query序列进行比对分析，以subject序列为模板进行组装和衍生Query序列。直到克隆拼接后的序列能够完整翻译。将拼接完成的新基因序列在NCBI数据库中进行比对搜索，确认为新基因序列。

1.2 PAL基因的序列分析

生物信息学分析方法涉及的数据库有：NCBI；主要软件有Bioedit、Visual Studio、MEGA 7；网络程序有ORFfinder、ExPASy、SMART、TMHMM、SignalP、NetPhos、NetNES、HNN、CPHmodels 具体如（表1）。

1.3 PAL基因的系统进化树构建

通过与NCBI数据库比对，发现该基因与马铃薯PAL序列的同源性为99%，为了进一步研究该基因与PAL之间的进化关系，选取了同源性最相近的21条序列进行同源进化比对，其中包括了马铃薯、番茄、辣椒和烟草中提取的序列，利用MEGA7软件构建同源进化树。

2 结果与分析

2.1 PAL基因全长的获取

在ORFfinder中查找该EST的潜在ORF可得ORF起始于第137位碱基，结束大于487位碱基，据此推测该EST尚不完整，需要对其克隆全长。以在NCBI中检索出的一条subject序列（登录号：LOC102596017）为模板对其进行拼接。拼接好的序列如下（见图1）。

2.2 PAL蛋白理化性质分析

利用在线软件ExPASy对蛋白质一级序列进行基本分析，结果表明：该基因表达的蛋白分子式为C3437H5533N965O1064S33，氨基酸数为722，分子量为78.5kDa，理论等电点为6.03，属酸性类型。带负电残基的总数（Arg+ Lys）为81，带正电残基总数（Arg+ Lys）为72；不稳定系数为35.03，小于40，为稳定蛋白；脂肪系数为90.66，为脂溶性蛋白；平均亲水系数为-0.187，为水溶性蛋白。该蛋白由20种氨基酸组成，其中含量最丰富为亮氨酸（Leu），最少为色氨酸（Trp）。

2.3 亚细胞定位和跨膜区分析

利用WoLF PSORT在线软件对该蛋白的亚细胞定位进行分析，结果表明，该蛋白位于叶绿体中的分值最高，故推断，PAL蛋白可能存在于植物的叶绿体内，并在叶绿体中行使功能。利用在线软件TMHMM对蛋白序列跨膜区分析，结果显示：预测的TMH数量为0，TMH中的AAs的Exp数为0.06378，小于18，为非膜蛋白。

2.4 磷酸化位点与信号肽分析

利用在线软件NetPhos对该蛋白磷酸化位点进行分析。预测结果显示：该蛋白具有38个磷酸化位点，其中丝氨酸有19个磷酸化位点，苏氨酸有9个磷酸化位点，络氨酸有10个磷酸化位点。利用在线软件SignalP对该蛋白信号肽位点进行预测。信号肽分值低于0.5，不存在信号肽，为非分泌蛋白。

2.5 核定位分析

利用在线软件NetNES进行核定位分析。结果显示：第66位氨基酸为赖氨酸，其NES评分为0.686，超过阈值， 预计该赖氨酸残基会参与核出口信号。

2.6 高级结构的预测

利用在线软件HNN及CPHmodels分析蛋白质的高级结构。结果表明：该蛋白由大量α-螺旋、无规卷曲及少量延展链构成，其中，346个氨基酸参与形成α-螺旋，占氨基酸总数的47.92%；333个氨基酸参与形成无规卷曲，含量为46.12%；43个氨基酸参与形成延展链，含量为5.96%（见图2）。

2.7 氨基酸同源进化树的构建

将PAL蛋白与其同源的21条氨基酸序列构建同源进化树（见图3）。结果表明：该蛋白与马铃薯其他同类基因的进化关系更近，与辣椒的同类基因的进化关系较为相近。因此推断该蛋白属于马铃薯PAL家族，并由此推测其可能同马铃薯PAL具有类似的活性和功能。

3 结论与讨论

本文运用多种生物信息学方法进行分析，结果显示：马铃薯PAL基因全长2529个碱基对，编码722个氨基酸，分子量为78.5kDa，理论等电点为6.03。此蛋白是脂溶性、亲水性的稳定蛋白，无结构功能域，无信号肽，无膜穿透性，共有38个磷酸化位点。通过对其高级结构的分析，发现有三种结构形式，分别为α-螺旋，无规卷曲和延展链，这为一些功能的实现提供了结构基础。

PAL酶的稳定性和积累量直接影响植株的抗逆能力[10]。黄小贞等报告了在PAL基因表达量高的条件下，相应产生的次生代谢产物产量随之升高，植株整体抗逆能力增强[4]。从这些同类研究中我们可以推论，对PAL基因的生物信息学分析及后续的基因功能研究将对其在马铃薯相关的抗病育种实践方面具有重要意义。本文仅为今后PAL在农业生产中的实际应用提供基本的理论基础，希望能够对其后续功能研究起到一定作用。

参考文献：

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