陈云霞，马 鑫，杨明睿

SSR（Simple sequence repeat）即简单序列重复，通常又被称为微卫星或短串联重复DNA，是以1～6个碱基为基本单元的串联重复序列，广泛存在于各种真核生物的基因组［1-2］，它不仅数量丰富，多态性高，相比于AFLP、RAPD、ISSR等分子标记技术具有更高的可靠性［3-4］.近年来，SSR在植物遗传研究方面成为一种比较常见的模式，是进行分子标记辅助育种和种质资源保护研究的重要工具.

银缕梅是金缕梅科具有较高科研价值和观赏价值的国家一级保护植物，是我国仅存的活化石树种.银缕梅分布区狭窄，仅在江苏宜兴、常州溧阳、安徽金寨和浙江安吉县龙王山的狭窄地域有少量野生植株，且开花周期长，平均2～5年开一次花，人工栽培要求也很高.在环境破坏和生物破坏等种种不利于银缕梅生长的因素下，银缕梅已处于极度濒危状态.基于上述原因开展银缕梅遗传多样性的研究，制定针对性种质资源保护方案刻不容缓.本研究拟通过正交实验设计及单因子试验，建立银缕梅的SSRPCR反应最佳体系，为进一步开展银缕梅遗传多样性研究以及建立银缕梅保护机制提供前期基础.

1 材料与方法

1.1 供试材料

银缕梅植物材料均采自江苏省宜兴林场大垄沟.植物叶片采用硅胶快速干燥保存.

1.2 方法

（1）银缕梅的DNA提取.取硅胶干燥的植物叶片0.1g，用研钵研磨粉碎，采用DNeasy Plant Mini Kit植物基因组DNA提取试剂盒（QIAGEN公司）抽提基因组DNA.DNA的浓度和质量采用紫外分光光度法和1.5%琼脂糖凝胶电泳法检测.

（2）银缕梅SSR-PCR反应体系的建立.对银缕梅SSR-PCR反应4因素（Ex-Taq Mix、DNA、引物-F、引物-R）进行4浓度梯度实验，共16个处理，反应体系如表1～2所示.该试验所用引物为课题组前期在转录组测序基础上设计并筛选的.

表1 银缕梅SSR-PCR反应体系正交试验L16（44）设计

表2 银缕梅SSR-PCR反应体系正交试验L16（44）因素水平组合处理

（3）银缕梅SSR-PCR反应单因子试验设计.对正交试验建立的SSR-PCR反应体系进行单因子试验，分析不同因素对银缕梅SSR-PCR反应的影响如表3所示.

表3 银缕梅SSR-PCR反应体系单因子试验设计

2 结果与分析

2.1 DNA提取与检测结果

利用QIAGEN公司DNeasy Plant Mini Kit植物基因组DNA提取试剂盒提取6份银缕梅叶片的基因组DNA，经琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示DNA条带清晰完整，质量较高，如图1所示，可用于进一步开展SSR-PCR反应.

图1 银缕梅DNA电泳检测

2.2 银缕梅SSR-PCR正交实验

银缕梅SSR-PCR 4因素4梯度正交试验如图2所示，16个处理中除1、2、5、9号处理无法扩增出条带外，其他处理均能扩增出条带，且每个处理重复效果基本一致.对有扩增结果的12个处理进行进一步比较，发现处理16条带最清晰，多态性最好，故选取处理16进行银缕梅SSRPCR反应体系单因子试验，分析不同因素对银缕梅SSR-PCR反应的影响.

图2 银缕梅SSR-PCR 4因素4梯度正交试验电泳

由图2可知，16条带的配量为DNA 5.0μL（20ng/μL），Ex-Taq Mix15.0μL，引物-F 2.0μL（10μmol·L-1），引物-R 2.0μL（10μmol·L-1）.

2.3 银缕梅SSR-PCR单因子实验结果

不同范本DNA浓度，Ex-Taq Mix、引物-F、引物-R对银缕梅反应均有一定影响，但主要影响因素为范本DNA，结果如图3所示.

图3 银缕梅SSR-PCR单因子试验电泳

（1）范本DNA对银缕梅SSR-PCR反应的影响.最佳DNA范本浓度取决于物种基因组大小及DNA范本纯度.范本量过低，因子碰撞的几率会降低，扩增产物少或不稳定；范本量过高，又会相应增加非特异性产物的扩增.比较25μL反应体系中范本DNA的4个浓度梯度2.5μL、3.5μL、4.5μL、5.5μL（20ng/μL）效果，以4.5μL（20ng/μL）的DNA范本量为最佳.

（2）Ex-Taq Mix对银缕梅SSR-PCR反应的影响.Ex-Taq Mix用量直接决定扩增反应成败，大量使用高浓度Ex-Taq Mix不仅成本高，造成较大的负担，而且易产生其他非特异性的扩增产物，但如果Ex-Taq Mix浓度较低，则会导致无法完成产物合成或者降低合成效率.Ex-Taq Mix用量在14.5～16.0μL范围时，以15.5μL效果最好，条带最亮、多态性最好.

（3）引物对银缕梅SSR-PCR反应影响.引物浓度会直接影响PCR结果可靠性.浓度较低时会引起无法检测出所有SSR位点，扩增效率低，会产生弥散的条带；浓度较高时会产生错配和非特异性扩增，且会增加引物二聚体的形成概率，从而降低扩增的效率.设置1.5μL、1.8μL、2.1μL、2.4μL（10μmol/L）4个梯度，浓度在2.4μL时条带最多且清晰，位点较多，所以引物2.4μL（10μmol/L）是银缕梅SSR-PCR体系引物最适浓度.

3 讨论

银缕梅分布区狭小，呈间断岛屿状散布于天目山北段及大别山东南部，现存种群个体数量极少，已濒于灭绝.濒危物种特别是高度特化的单种属植物在分类或遗传上最为独特而不可替代，所以对其的研究和保护尤为重要.然而近年来针对银缕梅开展的遗传多样性研究相对较少，还未提出科学有效的保护策略.通过本文的研究结果表明，银缕梅SSR-PCR反应最佳体系为（25μL）：Ex-Taq Mix 15.5μL，DNA 4.5μL（20ng/μL），引物-F 2.4μL（10μmol/L），引物-R 2.4μL（10μmol/L）.影响实验结果的每一种因素在上文已经分析得出，Ex-Taq Mix用量直接决定扩增反应成败.本实验优化的SSR-PCR反应体系与波斯银缕梅的反应体系相比，反应体系比波斯银缕梅大，体系反应时间也比波斯银缕梅长，但本实验采用混合PCR MasterMix扩增体系，使用方法更加简单，操作更加简便，反应所需要的时间也大大减少，实验效果也已经达到预期效果，优化后的反应体系，多态性位点比较清晰.