张 雷,李子超,王力平,高 翔,李 群

(1.青岛大学化学化工学院,山东青岛 266071;2.青岛大学生命科学学院,山东青岛 266071;3.中国海洋大学校医院,山东青岛 266100)

明日叶(Angelicakeiskei)属伞形科当归属,原产于日本太平洋沿岸八丈、伊豆等大岛,因今日摘叶、明日就能冒出新叶的强盛生命力而得名[1],在日本又被称为天赐之草、海峰人参、珍立草等。从1603年起,岛上居民就有食用明日叶的习惯,并将明日叶用于滋补、利尿、通便、催乳等。大量研究发现,明日叶中主要活性物质为查尔酮类物质,因其分子结构能与不同的受体结合,所以具有多重生理活性,如抗菌[2]、抗炎[3]、抗病毒[4]、抗氧化[5]、抗肿瘤、降“三高”、预防心脑血管疾病[6]等。目前明日叶在日本已认定为“健康食品级”,成为国民桌上的佳肴和常用于养生保健的功能性食品。如今肿瘤已成为危害人类健康的头号杀手,不仅给患者带来严重的并发症,而且给患者家属带来沉重的经济负担和巨大的身心压力。2014年世界卫生组织(WHO)统计表明,2012年全世界癌症病例新增1409万,死亡820万,其中我国新增和死亡病例均居世界首位,分别为307万(21.8%)和220万(26.9%),且这一数值呈逐年上升趋势[7]。面对如此严峻的形势,国内外科研人员加强了对抗肿瘤药物的研究,尤其是对天然产物抗肿瘤的研究越来越深入。明日叶查尔酮是从明日叶中分离出的一类黄酮类化合物,因其显著的抗肿瘤活性与极低的副作用引起国内外科研人员的广泛关注。本文对明日叶查尔酮抗肿瘤作用及其作用机制相关的国内外研究作一综述,以期为明日叶查尔酮抗肿瘤相关研究和明日叶天然查尔酮资源的进一步开发利用提供参考。

1 明日叶中查尔酮的种类和分布

1.1 明日叶中查尔酮的种类

明日叶查尔酮是具有1,3-二苯基丙烯酮结构(如图1)的黄酮类化合物的总称,是明日叶的主要活性成分。其中在明日叶折断的根茎或叶子中流出的黄色汁液干物质中,查尔酮类物质的含量高达90.2%[8]。至今已从明日叶中分离并鉴定了24种查尔酮类化合物,其分子式、中英文名称及来源见表1,其结构式见图2。

图2 从明日叶中分离鉴定的查尔酮衍生物结构式Fig.2 Chemical structures of chalcones isolated from A. keiskei

图1 查尔酮类化合物的骨架结构Fig.1 The chemical structure of chalcone

表1 从明日叶中分离鉴定的查尔酮衍生物Table 1 Identified chalcones from A. keiskei

1.2 明日叶中查尔酮的分布

Kim等[5]对明日叶中5种主要查尔酮类化合物(黄当归醇、4-羟基德里辛、异补骨脂查尔酮、黄当归醇B、黄当归醇F)在植物中不同部位的含量进行了检测(结果如表2所示),结果显示其在明日叶不同部位中含量有显著差异,5种明日叶查尔酮的总含量在明日叶不同部位的比较结果为:根皮(10.51 mg/g)>茎(8.52 mg/g)>叶子(2.63 mg/g)>根干(1.44 mg/g)。

表2 明日叶不同部位中5种查尔酮类化合物的含量Table 2 The 5 main chalcone contents in different parts of A. keiskei

2 明日叶查尔酮抗肿瘤作用

近年来,众多科研工作者通过建立肿瘤细胞模型与动物模型,研究发现明日叶中7种查尔酮类衍生物(主要为黄当归醇与4-羟基德里辛)对包括胃癌、肝癌、肺癌、子宫癌、白血病、骨肉瘤、黑色素瘤等14种肿瘤细胞具有优良的抗肿瘤活性(见表3)。在深入研究后发现明日叶查尔酮是通过诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞血管生成、增强机体细胞抗氧化能力、增强机体免疫力、抑制肿瘤细胞侵袭与转移等途径发挥抗肿瘤作用。

表3 明日叶查尔酮抗肿瘤作用相关研究Table 3 Researches on the anti-tumor activity of chalcones from A. keiskei

3 明日叶查尔酮抗肿瘤作用机制

3.1 诱导肿瘤细胞凋亡

大量研究表明,肿瘤的形成是细胞增殖调控与细胞凋亡发生紊乱的结果,细胞凋亡状态及其调控基因的异常参与了肿瘤的发生和发展[25]。目前公认的细胞凋亡发生机制主要有三条途径,即内源性线粒体介导途径、外源性死亡受体介导途径和内质网应激途径。已有研究报道通过细胞及动物实验证实明日叶查尔酮可引起人神经母细胞瘤、白血病、胃癌、肺癌、黑色素瘤等肿瘤细胞的凋亡,其作用机制可能通过调控凋亡相关因子的表达以及影响细胞凋亡信号传导等途径[16,18,21-22,26-28],但目前尚未有明日叶查尔酮影响内质网应激途径的相关研究报道。

3.1.1 对凋亡相关基因表达的调控Bcl-2家族基因根据其结构及功能可将该基因家族分为两类:抗凋亡基因(Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-W、Mcl-1、CED9等)与促凋亡基因(Bax、Bak、Bcl-XS、Bad、Bik、Bid等),细胞生命和凋亡的许多信号正是受这两类基因之间协同作用调控的[29]。在多种癌细胞中,Bcl-2蛋白通过抑制细胞凋亡促进癌细胞的增殖,而相应的micro RNA可通过下调细胞内的Bcl-2蛋白水平来使癌细胞凋亡[30]。孙赫等[27]研究发现明日叶查尔酮提取物可通过降低荷瘤小鼠H22肝癌细胞中Bcl-2蛋白表达水平,促进小鼠H22肝癌细胞的凋亡。Bax的同二聚体(Bax/Bax)能在肿瘤细胞外膜上产生大孔,并通过促进细胞色素C的释放进而促进肿瘤细胞凋亡,而Bcl-2/Bax的异源二聚体则会防止肿瘤细胞外膜上孔洞形成并抑制细胞凋亡[31]。孟扬等[26]研究了明日叶查尔酮提取物对荷瘤小鼠H22肝癌细胞Bax蛋白表达的影响,发现明日叶查尔酮可激发小鼠肿瘤细胞中Bax蛋白的表达,促进小鼠肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤细胞的增殖和生长。

3.1.2 影响细胞凋亡通路的信号传导

3.1.2.1 内源性线粒体介导的细胞凋亡通路 线粒体通透性转变孔的开放程度、线粒体跨膜电位的下降情况、线粒体中凋亡因子的释放量是线粒体介导细胞凋亡的主要途径[32]。半胱氨酸蛋白酶(caspase)家族蛋白存在于细胞浆中,组成细胞凋亡级联信号传导通路,在凋亡启动和执行过程中起关键作用。其中caspase-3为关键的执行分子,它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。大多数激发细胞凋亡的因素均需要通过caspase-3介导的信号传导途径导致细胞凋亡,当caspase-3激活时,细胞凋亡加速[33]。Tabata等[22]从明日叶茎中分离得到黄当归醇,并发现其能通过激活IMR-32神经母细胞瘤细胞和Jurkat白血病细胞中的caspase-3,来诱导细胞凋亡。孟扬等[26]研究了明日叶查尔酮提取物对荷瘤小鼠H22肝癌细胞caspase-3蛋白表达的影响,发现明日叶查尔酮可提高激活型caspase-3蛋白的表达来诱导H22肝癌细胞的凋亡。Nishimura等[28]发现异补骨脂查尔酮可显著促进pro-caspase-3和pro-caspase-9的水解,并随后提高激活型caspase-9和caspase-3的含量,通过线粒体途径诱导人神经母细胞瘤细胞IMR-32和NB-39的凋亡,并且对正常细胞没有细胞毒性。还有研究证实,4-羟基德里辛可促进细胞色素C的释放并激活pro-caspase-9,通过线粒体途径诱导人急性髓性白血病HL60细胞的凋亡[21]。

3.1.2.2 外源性死亡受体介导的细胞凋亡通路 Fas/FasL、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)这3条通路则是死亡受体介导细胞凋亡的主要形式[34]。Akihisa等[21]研究证实,4-羟基德里辛可促进肿瘤坏死因子(TNF)的释放,激活caspase-8和caspase-3,通过TNFR途径诱导人急性髓性白血病HL60细胞的凋亡。

3.2 抑制肿瘤血管生成

肿瘤血管可以为肿瘤细胞提供生长、侵袭与转移所必需的氧气、营养成分及肿瘤生长因子等,在肿瘤的发生、发展中发挥着重要作用。血管内皮生长因子(VEGF)是至今鉴定出来的最强效、最特异的促肿瘤血管生成因子,它的大量表达会促进肿瘤的生长和新生血管的形成。抑制肿瘤血管新生,切断肿瘤细胞的营养供应和转移途径已成为肿瘤治疗的新策略[35]。Kimura等[23-24]报道从明日叶根中分离的黄当归醇与4-羟基德里辛在LLC荷瘤小鼠体内实验中能够抑制肿瘤引起的新血管生成,并在基质胶血管生成实验中,1～100 μmol/L浓度的该两种明日叶查尔酮能够抑制人脐静脉内皮细胞(HUVECs)类毛细血管的生成。另外,黄当归醇还可通过阻断VEGF与血管内皮细胞的结合来抑制LLC肺癌小鼠肿瘤组织的血管生成。李子超等[36-37]在显微镜下观察到在每日喂食25～50 mg/kg明日叶查尔酮提取物11 d后可使H22肝癌荷瘤小鼠肝癌组织间质的血管变得稀疏并发生纤维化,其肿瘤组织微血管密度(MVD)显著下降,证实明日叶查尔酮对小鼠H22肝癌组织新血管生成具有抑制作用,并在进一步研究中发现其作用机制可能通过下调VEGF、缺氧诱导因子(HIF)-1α等重要促肿瘤血管生成因子的表达实现的。

3.3 抗氧化作用

一个正常细胞要转变成癌细胞必须经过两个阶段,即诱发与促进。大量研究证明,致癌的两个阶段都与活性氧(ROS)有关。在诱发阶段,活性氧既可直接损伤DNA,也可通过脂类过氧化而间接损伤DNA;在促进阶段,促癌剂能促使细胞产生活性氧间接攻击DNA。细胞对DNA损伤反应的异常将导致肿瘤的发生[38]。基于ROS的致瘤特性,食源性抗氧化剂已经成为潜在的预防肿瘤发生和抗肿瘤药物。研究证实,明日叶查尔酮具有清除DPPH自由基的活性[39]和有效的超氧化物清除活性[15]。侯芳霖等[40]发现明日叶查尔酮提高了H22肝癌荷瘤小鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活力、并降低了脂质过氧化的重要标志物——丙二醛(MDA)的含量,同时也显著降低了肿瘤细胞的增殖活性。提示明日叶查尔酮的抗肿瘤作用与H22肝癌小鼠细胞的抗氧化能力增强有关。

3.4 增强机体免疫力

机体免疫功能影响肿瘤的发生和发展,而随着肿瘤的进展,能反向抑制机体的免疫功能。明日叶查尔酮可通过T淋巴细胞和自然杀伤细胞等多种途径增强机体的免疫能力,在抗肿瘤过程中发挥重要的作用。Kimura等[24]发现4-羟基德里辛能抑制小鼠脾脏淋巴细胞、CD4+、CD8+和NK-T细胞四种免疫细胞数目的减少并显著降低了LLC肺癌小鼠肿瘤的质量,提示4-羟基德里辛的抗肿瘤作用可能与其增强LLC肺癌小鼠免疫力有关。

3.5 抑制肿瘤细胞侵袭和转移

侵袭与转移是恶性肿瘤的主要生物学特性。侵袭是指恶性肿瘤细胞侵犯和破坏周围正常组织,进入循环系统的过程。转移则是指侵袭中的癌细胞迁移到特定组织器官并发展成为继发性癌灶的过程。肿瘤侵袭与转移主要受上皮-间质转化(EMT)、细胞外基质(ECM)降解、黏附作用及肿瘤血管形成等多重因素影响[41]。Kimura等[23]发现黄当归醇能够显著降低转移至肝脏的LLC小鼠肺癌细胞的数量,并且发现荷LLC肺癌小鼠在口服50 mg/kg黄当归醇15 d后,原发肿瘤的生长和肿瘤向肺部的转移均受到显著的抑制,荷瘤小鼠存活时间也同时得到延长。该研究团队又进一步发现[24],4-羟基德里辛也能够抑制LLC肺癌荷瘤小鼠癌细胞转移,其原因是由于4-羟基德里辛能显著抑制肿瘤诱导的新血管的形成所引起的。近年来,肿瘤微环境在肿瘤发生、发展过程中的重要作用,引起了人们的高度重视。而作为肿瘤基质中重要的免疫抑制细胞——肿瘤相关巨噬细胞(TAMs),参与了肿瘤发生、生长、侵袭和转移等过程,已经成为了潜在的肿瘤治疗新靶点[9]。Sumiyoshi等[20]通过建立高转移度骨肉瘤LM8荷瘤小鼠模型,发现每日两次喂食25或50 mg/kg黄当归醇和4-羟基德里辛可以抑制小鼠瘤组织向肺与肝脏转移,并抑制了瘤组织中TAM的表达,其机理是通过抑制肿瘤微环境中M2型巨噬细胞的激活与分化作用。

3.6 其他可能作用机制

有资料显示,恶性肿瘤细胞中钙调蛋白的含量均会大幅增加,因此许多抗癌药物,正是通过抑制钙调蛋白的活性或降低钙调蛋白的含量来达到治疗恶性肿瘤的目的[42]。Okuyama等[43]通过荧光法检测发现浓度为1 μg/mL黄当归醇和0.5 μg/mL 4-羟基德里辛可有效抑制Ca2+-钙调蛋白加强的N-苯基-1-萘胺的荧光强度,提示该两种明日叶查尔酮可通过调节Ca2+-钙调蛋白系统促进抗肿瘤作用。

4 结语与展望

虽然目前已有较多明日叶查尔酮抗肿瘤作用相关研究,包括体外细胞实验和小鼠体内实验,但多数研究仅探索了在明日叶中含量较多且相对容易提取、分离的两种主要的明日叶查尔酮衍生物(黄当归醇和4-羟基德里辛)的抗肿瘤作用,其余多种查尔酮相关研究仍需开展。另外,目前研究对其主要作用靶点以及确切的分子水平作用机理仍需深入研究并阐明。同时,目前虽已有明日叶查尔酮能通过引起肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞血管生成、增强机体细胞抗氧化能力、增强机体免疫力、抑制肿瘤细胞侵袭与转移等途径发挥抗肿瘤作用,但关于明日叶查尔酮对阻滞肿瘤细胞增殖周期以及对药物增敏及逆转耐药性的相关研究尚未开展。再者从临床角度上,相关体内实验和临床实验仍需开展,来进一步确认明日叶查尔酮的抗肿瘤效果。