李 嫒,李厚华,刘小微,韩美玲,毛沛琪

(西北农林科技大学风景园林艺术学院,陕西杨凌 712100)

海棠为蔷薇科苹果属(Malus)中果实直径小于等于5 cm的种和品种的统称[1]。在我国,海棠不仅可用于园林观赏,还具有很多其他方面的应用价值,市场上有以海棠果为原料的果汁饮料[1],湖北海棠的叶子还可用来做茶[2]。此外,关于海棠果实的药用价值也有相关报道[3-5]。研究表明,海棠果实中含有大量的多酚[6]。多酚是植物体内重要的次生代谢产物,具有多种保健功能,如抗炎、抗氧化、抗肿瘤以及抑菌等[7-10]。

胃癌是全球最常见的消化道恶性肿瘤之一。随着经济发展和生活水平的提高,食品形式出现多样化,人们容易形成不良饮食习惯,使胃癌的发生几率大大增加。根据Chen等[11]2015年的统计数据显示,胃癌在我国恶性肿瘤中是发病率和死亡率居第二位的疾病。大部分胃癌患者确诊疾病时已为晚期,且治疗难度系数高,容易复发。在我国,胃癌患者术后的五年存活率仅为20%～25%[12]。因此,完善个人饮食习惯,积极预防胃癌就显得尤为重要。植物多酚作为一种天然的抗氧化剂,其对胃癌细胞的抑制作用已有相关报道,Feng[13]等研究发现，杨梅素对HGC-27和SGC7901两种胃癌细胞具有抑制作用,Huang[14]等研究发现，桑葚花青素可通过体外受体途径诱导胃癌细胞的凋亡。

海棠与苹果都属于蔷薇科苹果属,其果实都富含多酚类物质。有关苹果多酚对胃癌细胞的抑制作用已有相关报道,Serra[15]等对比了9种苹果提取物对胃癌细胞MKN45的抑制作用,并得出以原花青素B1、原花青素B2和表儿茶素为主的多酚类物质是苹果对MKN45细胞产生抑制作用的主要因素。本实验以4种海棠果实为试验材料,以‘富士’苹果为对照,对5种果实提取物所含多酚的种类和含量进行鉴定,并通过细胞活力检测试剂盒(EnoGeneCellTMCounting Kit-8,CCK-8)，研究海棠果实多酚提取物对BGC-803细胞的体外抑制作用,为其能否防治癌症提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

海棠果实 品种为红果肉的‘亚当’海棠(Malus‘Adams’)和‘红丽’海棠(Malus‘ Red splendor’),黄果肉的‘海红果’海棠(Malusmicromalus‘Haihongguo’)、西府海棠(Malusmicromalus)和‘富士’苹果(Malusdomenstica‘Fuji’),采自西北农林科技大学海棠资源圃;甲醇、乙腈为色谱纯 品谱公司;乙酸(色谱纯) Kermel化学试剂公司;DPPH 西格玛奥德里奇公司;ABTS 沃尔森公司;乙醇、Na2CO3、NaNO2、AlCl3等(均为分析纯) 宜科生物科技有限公司;没食子酸、原花青素B1、原花青素B2、丁香酸、芦丁、绿原酸、根皮苷、异槲皮苷、瑞诺苷 天津易方科技有限公司;儿茶素、表儿茶素、槲皮苷、咖啡酸、对香豆酸、广寄生苷、金丝桃甙、矢车菊素-半乳糖苷 金测分析技术有限公司;RPMI1640培养基、胎牛血清、DMSO Gibco公司;人胃癌细胞株BGC-803、EnoGeneCellTMCounting Kit-8(CCK-8)细胞活力检测试剂盒 南京恩晶生物科技有限公司;紫杉醇注射液 四川太极制药有限公司，浓度:5 mL∶30 mg，作为体外抑制活性试验的阳性对照药。

UV-2450紫外可见分光光度计 日本岛津公司;岛津LC-20AT 高效液相色谱仪 日本岛津公司;MCO-15AC二氧化碳培养箱 日本三洋公司;XD-202荧光倒置生物显微镜 南京江南永新光学有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备 将采下的新鲜果实去芯、梗,切成片状,厚度约为3 mm,在-80 ℃冰箱中预冻12 h后,在-50 ℃下真空冷冻干燥72 h,完全干燥后研磨成粉末密封,在阴凉干燥处保存备用。

多酚提取:参照Zhang[16]等的方法,略作修改。称取完全干燥后的样品粉末0.03 g,用1.2 mL提取液(甲醇∶甲酸∶水=70∶2∶28)提取,10000×g 离心10 min。上清液经过 0.45 μm 的滤头过滤后，置于4 ℃冰箱中保存备用。

肿瘤细胞抑制活性实验样品提取:参照曹军等[17]的方法,略作修改。将研磨好的粉末各称取200 g,用纯甲醇按液料比1∶5 g/mL浸提三次,每次12 h。收集三次提取液,旋转蒸发浓缩至浸膏状,加100 mL蒸馏水溶解浸膏,然后再加50 mL蒸馏水冲洗两次,收集三次所得溶液,6000 r/min离心5 min,取上清液加石油醚(上清液∶石油醚=4∶1)于4 ℃冰箱中萃取12 h,除去油脂类物质,重新浓缩至浸膏,并于-20 ℃冰箱中保存备用。

1.2.2 总多酚含量测定 没食子酸标准曲线制作:参考Yi[18]等方法并略做修改。将没食子酸配制成浓度为104 μg/mL的标准液,取6 只10 mL离心管,分别加入标准液:0、0.1、0.3、0.5、0.8、1.0 mL,后依次加入蒸馏水:7.8、7.7、7.5、7.3、7.0、6.8 mL,再依次加入0.5 mL福林-酚试剂和1.7 mL 20% Na2CO3,室温反应90 min,760 nm测吸光值A。以没食子酸浓度(μg/mL)为横坐标,吸光值为纵坐标绘制标准曲线,得到回归方程为y=0.1196x(R2=0.9970),根据该回归方程计算待测样品中酚类物质的含量。

样品总多酚含量测定:取10 μL提取液,依次加入3.16 mL的蒸馏水和200 μL 福林-酚试剂,混匀,反应1 min,后加600 μL 20% Na2CO3混匀,避光反应30 min,测定760 nm下吸光值。结果以每100 g样品中所含的没食子酸当量(mg GAE/100 g)表示。每个样品做三个重复,结果表示为平均值±标准偏差。

总多酚含量计算:

式中:c为标准曲线计算出的浓度;v1为提取液的体积;v2为测定时吸取提取液的体积;v3为测定时反应体系的体积;m为称取的样品质量。

1.2.3 单体酚含量的测定 对所提样本进行HPLC-DAD检测,参考Zhang等[16]的方法,并略作修改。使用 Inertsil ODS-3色谱柱(5.0 μm,4.6 mm×250 mm)进行物质分离,所用保护柱为 InertsilODS-3 保护柱(5.0 μm,4.0 mm×10 mm)。流动相A为10%甲酸加水,流动相B为10%甲酸加乙腈;梯度洗脱条件:95% A(0 min)、85% A(25 min)、78% A(42 min)、64% A(60 min)、95% A(65 min),后运行10 min;流速1.0 mL/min,柱温30 ℃,280、320、365、520 nm四个波长同步检测。每个样品做三个重复检测,将所测样品的出峰时间和紫外扫描光谱与标准品进行比对,确定单体酚种类,根据峰面积和标准曲线计算单体酚含量。

1.2.4 海棠果实多酚提取物对BGC-803细胞增殖抑制作用的测定

1.2.4.1 细胞培养 将人胃癌细胞BGC-803培养在含有10% 胎牛血清、100 μg/mL青霉素和50 μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基中,于37 ℃、5% CO2饱和湿度的恒温细胞培养箱中培养。待试细胞株每2 d换液,按照1∶4传代培养。

1.2.4.2 细胞活力的测定 取活细胞比例达90%以上的细胞进行实验。细胞增殖抑制试验采用CCK-8细胞活力检测试剂盒。当细胞分裂生长呈对数期时,将贴壁细胞BGC-803经胰酶消化制成单细胞悬液之后,计数、制成浓度为1×105个/mL的细胞悬液,96孔板中每孔加入100 μL细胞悬液(每孔1×104个细胞);铺板完成后，将96孔培养板置于37 ℃,5% CO2培养箱中，培养24 h使细胞贴壁;每孔加入100 μL相应的含药物的培养基,每种浸膏浓度设置10个梯度(浓度设置由预实验而定),其中‘红丽’海棠和‘亚当’海棠醇提物10个浓度梯度由高到低分别为500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.813、3.906、1.953、0.977 μg/mL;‘海红果’海棠、西府海棠和‘富士’苹果醇提物的10 个浓度梯度由高到低分别为2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.813、3.906 μg/mL。同时设立阴性对照组(不添加醇提物和紫杉醇),阳性对照组(添加10 μg/mL紫杉醇),每组5复孔。

96孔板置于37 ℃,5% CO2培养箱中，培养72 h后,每孔加入10 μL CCK-8溶液,将培养板在培养箱内孵育4 h,用酶标仪测定在450 nm处的OD值,计算人胃癌细胞BGC-803的抑制率及IC50值。

1.2.4.3 细胞形态学观察 当细胞分裂呈对数期时,将贴壁细胞BGC-803经胰酶消化制成单细胞悬液之后,分别接种至3.5 cm培养皿中,细胞密度为5×105个/皿,每个皿培养基为2 mL。铺皿完成后，将小皿置于各自细胞培养箱中培养24 h使细胞贴壁。然后吸掉旧培养基,加入含有不同浓度海棠果醇提物的新鲜培养基，于37 ℃，5% CO2恒温培养箱中培养72 h,同时设置阴性对照组(不添加醇提物和紫杉醇),阳性对照组(添加10 μg/mL紫杉醇)。培养时间到达后,在倒置荧光显微镜下观察细胞形态变化。

1.3 数据分析

2 结果与分析

2.1 海棠果实提取物总多酚含量分析

总多酚含量检测结果如表1所示。由表1可知,5种果实提取物均含有较高含量的多酚;‘亚当’、‘红丽’、‘海红果’、‘西府’4种海棠果实提取物总多酚含量变化范围为573.74～4663.30 mg GAE/100 g,均高于‘富士’苹果的总多酚含量(405.99 mg GAE/100 g);红果肉的‘亚当’海棠和‘红丽’海棠的总多酚含量最高,分别为3525.21、4663.30 mg GAE/100 g(表1),达到‘富士’苹果的8～11倍;‘海红果’海棠果实的多酚含量也较高,为‘富士’苹果的5.12倍。

表1 5种果实提取物总多酚含量Table 1 Total polyphenol contents of five fruits extracts

2.2 单体酚种类及含量

单体酚的检测结果表明,5种果实提取物所含的单体酚有原花青素B1、儿茶素、原花青素B2、表儿茶素、没食子酸、丁香酸、绿原酸、根皮苷、芦丁、金丝桃甙以及矢车菊素半乳糖苷等17种。4种海棠果实与‘富士’苹果的多酚类物质基本一致,但含量差异较大。海棠果实中含有大量的原花青素B1、原花青素B2、儿茶素、表儿茶素,其中,红果肉的‘亚当’海棠和‘红丽’海棠的含量明显高于‘海红果’海棠和西府海棠。矢车菊素半乳糖苷在‘亚当’海棠和‘红丽’海棠果实中有大量分布,含量分别为345.96、190.17 mg/kg,而在其他果实多酚提取物中含量较低或未检测到。大多数单体酚在海棠果实中的含量高于‘富士’苹果,而绿原酸在‘富士’苹果中含量高于4种海棠果实,为91.62 mg/kg。此外,其他一些单体酚如咖啡酸、对香豆酸和槲皮苷的含量则相对较低或未检测到(表2)。

表2 5种果实提取物的单体酚含量(mg/kg)Table 2 Mono-phenol content in 5 fruits extracts(mg/kg)

2.3 海棠果实多酚提取物对BGC-803细胞的抑制活性

2.3.1 海棠果实多酚提取物对BGC-803细胞的增殖的抑制率 结果显示,5种果实多酚提取物均对BGC-803细胞增殖出现不同程度的抑制作用。随着提取物质量浓度的增加,对BGC-803细胞的抑制率均呈现逐渐升高的趋势;5种果实多酚提取物对人胃癌细胞BGC-803的抑制作用(IC50值)比较显示,红果肉的‘亚当’海棠(42.29 μg/mL)和‘红丽’海棠(64.67 μg/mL)优于黄果肉的‘海红果’海棠(1466.00 μg/mL)和西府海棠(2291.00 μg/mL),4 种海棠果实均优于‘富士’苹果(3476.00 μg/mL)(图1)。

图1 五种果实多酚提取物对BGC-803细胞增殖的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of five fruits extracts on the proliferation of BGC-803 cells注：A：‘亚当’海棠；B：‘红丽’海棠；C：‘海红果’海棠；D：‘西府’海棠；E：‘富士’苹果。

2.3.2 海棠果实多酚提取物处理后胃癌细胞BGC-803的数量变化 用倒置显微镜观察5种果实多酚提取物对BGC-803细胞的抑制效果,结果如图2所示。阴性对照组细胞形态饱满,分布紧密,生长状态良好。用不同浓度的‘海红果’海棠、西府海棠和‘富士’苹果果实多酚提取物处理72 h后,BGC-803细胞出现数量减少、生长密度降低的趋势,且随着浓度的升高,这种变化越来越明显。用不同浓度的 ‘亚当’海棠和‘红丽’海棠果实多酚提取物处理72 h后,BGC-803细胞数量明显减少,显示出良好的对BGC-803细胞增殖抑制效果。表明5种果实多酚提取物对BGC-803细胞都具有很强的抑制作用,红果肉的‘亚当’海棠和‘红丽’海棠果实多酚提取物对BGC-803细胞抑制效果明显优于黄果肉的‘海红果’海棠、西府海棠和‘富士’苹果果实多酚提取物。

图2 倒置显微镜下不同浓度的五种果实多酚提取物对BGC-803细胞处理72 h后的细胞形态(100×)Fig.2 Morphologic changes of BGC-803 cells observed under an inverted microscope BGC-803 cells treated withvarious concentrations of five fruits extracts for 72 h(100×)注:M:阳性对照(经紫杉醇注射液处理);N:阴性对照(未经处理);A:‘亚当’海棠;B;‘红丽’海棠;C:‘海红果’海棠;D:西府海棠;E:‘富士’苹果；a～e提取物浓度分别为a. 31.25 μg/mL;b. 125.00 μg/mL;c. 500.00 μg/mL;d. 1000.00 μg/mL;e. 2000.00 μg/mL。

2.4 多酚含量与对BGC-803细胞抑制活性的相关性

相关性分析结果表明,海棠果实提取物总酚含量与对BGC-803的抑制活性相关性系数为0.942,在0.05水平上呈显著相关。因此,在以后的有关海棠果实抗癌活性中,可以通过测定多酚含量来初步预测其对癌细胞增殖的抑制活性。

3 结论与讨论

结果表明,5种果实提取物都具有较高含量的多酚，均对BGC-803细胞有抑制作用;4种海棠果实多酚提取物对BGC-803细胞增殖的抑制作用均高于‘富士’苹果;红果肉的‘亚当’海棠、‘红丽’海棠对BGC-803细胞增殖的抑制作用最强,其IC50值分别为42.29、64.67 μg/mL,显著优于黄果肉的‘海红果’海棠(1466.00 μg/mL)、西府海棠(2291.00 μg/mL)和‘富士’苹果(3476.00 μg/mL);试验样品总多酚含量和对BGC-803细胞增殖的抑制作用呈显著相关性(r=0.942)。

原花青素B1、原花青素B2是由儿茶素和表儿茶素等单体通过一个C4-C6或C4-C8键连接起来的原花青素类二聚体[19],研究表明低聚原花青素类多酚物质具有很强的抗癌活性[20-22]。4种海棠果实多酚提取物中的原花青素B1、原花青素B2、儿茶素、表儿茶素含量均明显高于‘富士’苹果,因此大量的以原花青素为主的多酚类物质很可能是使海棠果实抗癌活性高于‘富士’苹果的主要原因。

花青苷是一种重要的多酚类物质,它不仅是使果实着色的主要成分,还具有很强的抗氧化能力,对癌症也有一定的抑制作用[23-26]。矢车菊素半乳糖苷是一种常见的花青苷,它是苹果属植物果实呈现红色的主要原因,Tsao[27]等用FRAP法检测得出矢车菊素半乳糖苷是苹果里抗氧化活性最强的多酚物质。‘亚当’海棠和‘红丽’海棠的果实多酚提取物中检测到较高含量的矢车菊素半乳糖苷,而在‘海红果’海棠、西府海棠、‘富士’苹果中没有或者含量很低。因此,花青素及其衍生物是使红果肉的‘亚当’海棠和‘红丽’海棠对BGC-803细胞增殖抑制活性强的重要原因。研究表明,花青素可以有选择的抑制癌细胞的增殖,而对正常细胞几乎没有影响[28],食用富含花青苷的食物对人体具有很高的保健价值,虽然这两种红果肉海棠直接鲜食口感一般,但可以为海棠果脯、果汁加工提供良好的原材料,也可以为高保健功能的鲜食果用海棠育种提供优良的亲本。