伍冬志,汪 立,廖云霞,陈 偲,汪开拓

(重庆三峡学院生命科学与工程学院,重庆 404100)

草莓(Fragaria×ananassa)为多年生蔷薇科草莓属草本植物,在全球各地均有广泛种植,其果实具有外观鲜艳、口感圆润、酸甜可口及滋味丰富等优质食用特征,且富含维生素、酚酸、花色苷及其他各种微量元素,营养价值较高[1]。但因草莓果实糖酸含量高,内部组织柔软多汁且无外皮屏障,故极易在贮运环节中受到病原真菌的侵染而发生大面积病害,造成严重损耗。B.cinerea是草莓果实中低温贮运环节中最主要的病原菌[2];长期以来,施用化学杀菌剂可较好地控制B.cinerea在草莓果实表面的增殖,但多年连续使用化学杀菌剂可使病菌产生抗性,不仅降低了药剂的防腐效果,还易导致严重的农药残留,直接危害人体健康并污染环境[3]。近年来的研究证实,茉莉酸及其甲酯、水杨酸、β-氨基丁酸、赤霉素或乙烯等绿色的植物内源激素类激发子可通过激活草莓、葡萄、杨梅和蓝莓等多种浆果类果实自身防卫反应来抵御灰霉菌或青霉菌的侵染,从而有效减少化学药剂用量,因此逐渐受到关注[4]。

众多转录因子在植物防卫反应中发挥着重要作用[5]。研究表明,植物细胞内部的还原势可直接决定转录因子的结构和功能:植物众多转录因子通常以低活性的共聚体形式存在,但当植物受病菌胁迫或激发子诱导后,其细胞内的还原势迅速升高,可将转录因子中的二硫键还原为巯基,进而产生大量转录因子的活性单体,随后在核定位信号的作用下由细胞质进入细胞核中与病程相关(pathogensis-relatedproteins,PRs)基因特异性启动子结合,最终激活PRs基因[6]。苯丙噻唑硫代乙酸甲酯(BTH)是非感光的功能性水杨酸类似物,可有效诱导水蜜桃[7]、葡萄[8]、香蕉[9]和芒果[10]等多种果实PRs基因的表达和植保素合成等抗病性反应,从而抑制病原菌侵染,但其中有关还原势变化与诱导抗性之间的关联仍不明确。实验室前期研究已证实，0.1 mmol/L BTH处理可有效降低葡萄[8]和草莓果实[11]贮藏期间腐烂率,本研究以此为基础,分析BTH处理对抗坏血酸-谷胱甘肽(AsA-GSH)循环、磷酸戊糖(PPP)途径的影响以及抗病性的诱导作用,以期发现草莓果实还原势和抗病性的消长规律。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

草莓果实(Fragaria×ananassacv. ‘Fengxiang’) 大小一致、转色均匀并达到商业成熟度(八分熟),采摘于重庆市潼南区太安镇有机草莓种植果园,随后1 h内运回实验场所,挑出尚有破损及病斑果实,剩下果实仔细排列在实验桌上于室温下自然风散去田间热;BTH 美国Sigma-aldrich公司;谷胱甘肽还原酶(GR)活性测定试剂盒、GSH-POD活性测定试剂盒、NADP+/NADPH含量测定试剂盒、还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)含量测定试剂盒 南京建成生物工程研究所;RNAprep Pure(多糖多酚植物总RNA提取)试剂盒 天根生化公司;SuperScript II试剂盒 美国Invitrogen公司;B.cinereaPers.:Fr菌株冻干粉 中国微生物菌种保藏管理委员会(CCCCM)。

DW-86L338J型超低温冰箱 海尔公司;UV2600i紫外可见分光光度计 日本岛津公司;BSC-150恒温恒湿培养箱 上海博迅医疗生物仪器股份有限公司;DYCP-31D型核酸电泳仪 北京六一仪器厂;PTC-200型RT-PCR仪器、Gel Doc XR型凝胶成像仪 美国伯乐公司;DW-86L338J型超低温冰箱 青岛海尔特种电器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 BTH处理和病原菌接种B.cinerea菌株冻干粉经活化并传代培养7 d后(25 ℃),用无菌生理盐水(内含0.02% Tween-80)提取孢子,用血球计数板调节悬浮液中孢子浓度至5×104个/mL。

用75%乙醇溶液对上述已散去田间热的草莓果实进行表面消毒,随后用无菌解剖针在果实直径最大部位对称穿刺2个孔(穿孔直径2 mm,深度2 mm),再随机分成四份:a. 对照组,用移液枪在草莓果实每个穿刺部位注入10 μL的无菌蒸馏水;b.B.cinerea接种组,用移液枪在草莓果实每个穿刺部位注入10 μL 5×104个/mL的B.cinerea孢子悬浮液;c. BTH处理组,用移液枪在草莓果实每个穿刺部位中注入10 μL 0.1 mmol/L的BTH溶液;d. BTH+B.cinerea接种组,草莓果实每个穿刺部位中先注入10 μL 0.1 mmol/L的BTH溶液,于20 ℃下贮藏 6 h后，再在各穿刺部位接种10 μL 5×104个/mL的B.cinerea孢子悬浮液。

以上操作温度控制在(20±1) ℃。各处理完成后,将草莓果实每8个分装于一个聚乙烯塑料盒中,在(20±1) ℃、90%±5% RH下贮藏5 d。每天观察果实灰霉病发病状况,并取健康果肉组织在液氮中速冻,-80 ℃下保存备用。各处理包含240颗果实,重复3次,整个实验重复2次。

1.2.2 指标测定

1.2.2.1 发病率和病斑直径 发病率(%)=(穿刺处出现霉菌性病害果实数/总果实数)×100;病斑直径用游标卡尺直接进行测量。

1.2.2.2 G6PDH和6PGDH活性的测定 称取2 g果实冻样,加入10 mL内含30 mmol/L甘露醇、5 mmol/L MgSO4、5 mmol/L KCl和1 mmol/L EDTA的50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.2)仔细冰浴匀浆,再以5000×g离心10 min(4 ℃)后取上清液测定酶活性。G6PDH和6PGDH活性参照indelá等[12]的方法进行测定,以反应液中每分钟生成1 nmol NADPH为1个酶活力单位,以U/mg蛋白表示结果。

1.2.2.3 脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)和单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)活性的测定 称取2 g果实冻样,加入10 mL 内含1 mmol/L EDTA、1 mmol/L AsA和1%交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)的50 mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0)仔细冰浴匀浆,再以5000×g离心10 min(4 ℃)后取上清液测定酶活性。参考Shigenaga等[13]方法测定DHAR和MDHAR活性,以反应液在340 nm处吸光值每分钟上升0.001为1个DHAR酶活性单位,以反应液在265 nm处吸光值每分钟上升0.001为1个DHAR酶活力单位,以U/mg蛋白表示结果。

1.2.2.4 谷胱甘肽还原酶(GR)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性的测定 称取2 g果实冻样,加入7 mL内含2 mmol/L EDTA和2 mmol/L二硫苏糖醇(DTT)的50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.2)仔细冰浴匀浆,再以5000×g离心10 min(4 ℃)后取上清液测定酶活性。参考Cai等[14]方法用试剂盒测定GR(GSH还原法)活性;参考Xu等[15]方法测定APX活性,以反应液在290 nm处吸光值每分钟下降0.001为1个APX酶活性单位,结果以U/mg蛋白表示。

1.2.2.5 AsA和DHA、NADPH和NADP+以及GSH和GSSG含量的测定 AsA和DHA含量参考Kampfenkel等[16]方法进行测定;NADPH和NADP+参考Nagano等[17]的硫酸甲酯吩嗪反应法进行测定(试剂盒法);GSH和GSSG参考Rahman等[18]的酶循环法,利用5,5′-二硫硝基苯甲酸反应进行测定(试剂盒法)。

1.2.2.6PRs基因表达丰度的测定 取1 g果实冻样使用适合多糖多酚类样品RNA提取的RNAprep Pure试剂盒进行果实RNA的提取(4 ℃)。取1 mg RNA采取SuperScript II试剂盒逆转录cDNA第一链,Oligo(dT)为引物。用Premier 7.0软件设计相关基因特异性引物(表1)。以草莓18S rRNA基因为内参。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离,经EB染色后，用凝胶成像仪扫描并定量分析[19]。

表1 草莓PRs基因特异性引物序列Table 1 Sequence of primers used for PRs genes in strawberries

1.3 数据分析

果实发病率和病斑直径重复测定5次,其余指标均重复测定3次。采取Duncan氏多重比较法进行差异显著性检验(SPSS 13.0),0.05和0.01分别表示显著和极显著差异水平。

2 结果与分析

2.1 BTH处理和B. cinerea接种对草莓果实灰霉病的影响

由图1可知,草莓果实在20 ℃贮藏时发病率及病斑直径逐渐上升,至贮藏结束时,对照果实发病率达到39.8%,病斑直径达3.72 mm;单一BTH处理有效抑制了果实腐烂的发生,贮藏5 d后果实发病率和病斑直径分别较对照果实下降了56.3%和39.3%。接种病原菌B.cinerea后,草莓果实灰霉病症状急剧发展,贮藏5 d后果实发病率达到65.8%,病斑直径达4.66 mm;BTH显著抑制了果实贮藏期间由B.cinerea导致的灰霉病的发生(p<0.05),贮藏结束时果实发病率和病斑直径分别较单一B.cinerea接种果实下降了74.2%和41.4%。

图1 BTH处理和B. cinerea接种对草莓果实灰霉病发病率(A)和病斑直径(B)的影响Fig.1 The effects of BTH treatment and B. cinerea inoculation on disease incidence(A)and lesion diameter(B)in strawberries during the storage for 5 days注:不同字母表示存在显著性差异(p<0.05)。

2.2 BTH处理和B. cinerea接种对草莓果实贮藏期间磷酸戊糖途径关键酶活性的影响

由图2可得,对照组草莓果实在20 ℃贮藏期间,其G6PDH活性在贮藏前3 d逐渐上升,随后迅速下降;6PGDH活性则呈逐渐下降趋势。相比于对照果实,B.cinerea接种显著降低了G6PDH和6PGDH活性(p<0.05);而BTH处理则显著诱导了G6PDH和6PGDH活性的上升(p<0.05),使G6PDH活性在整个贮藏期间以及6PGDH活性在贮藏后期均高于对照。经BTH处理并接种病原菌的果实中G6PDH和6PGDH活性急剧上升,在整个贮藏期间均显著高于单一BTH处理果实(p<0.05)。

图2 BTH处理和B. cinerea接种对草莓果实G6PDH(A)和6PGDH(B)活性的影响Fig.2 The effects of BTH treatment and B. cinerea inoculation on activities of G6PDH(A)and 6PGDH(B) in strawberries during the storage for 5 days

2.3 BTH处理和B. cinerea接种对草莓果实贮藏期间AsA-GSH循环关键酶活性的影响

由图3可知,对照草莓果实中MDHAR、DHAR、GR和APX活性均随贮藏时间的延长而呈缓慢下降趋势,经单一B.cinerea接种的果实中，MDHAR、DHAR和APX活性在整个贮藏期间缓慢下降(p<0.05),GR活性则在贮藏前4 d显著低于对照果实(p<0.05)。BTH处理可延缓这四种AsA-GSH循环关键酶在贮藏期间活性的下降,使四种酶活性在整个贮藏期间均显著高于对照水平(p<0.05)。BTH+B.cinerea接种处理较单一BTH处理更为显著地诱导了GR和APX活性的上升(p<0.05),同时促使果实DHAR活性在贮藏后2 d显著高于单一BTH处理(p<0.05);此外,经BTH+B.cinerea接种果实中MDHAR活性与经单一BTH处理果实相比无显著差异(p>0.05)。

图3 BTH处理和B. cinerea接种对草莓果实贮藏期间MDHAR(A)、DHAR(B)、GR(C)和APX(D)活性的影响Fig.3 The effects of BTH treatment and B. cinerea inoculation on activities of MDHAR(A)、DHAR(B)、GR(C)and APX(D)in strawberries during the storage for 5 days

2.4 BTH处理和B. cinerea接种对草莓果实贮藏期间NADPH和NADP+含量的影响

由图4所示,对照草莓果实NADPH含量在贮藏前3 d缓慢上升,随后逐渐下降;NADP+含量则在贮藏期间逐渐上升。经单一B.cinerea接种的果实中NADPH在贮藏第1 d出现明显上升,随后急剧下降并显著低于对照水平(p<0.05);同时,B.cinerea接种促进了果实中NADP+的积累,使其在整个贮藏期间均显著高于对照果实(p<0.05)。除贮藏第3 d外,BTH处理在这个贮藏期间均显著诱导了果实中NADPH合成并降低了NADP+含量(p<0.05),而BTH+B.cinerea接种处理则较单一BTH处理更为显著提高了NADPH含量并降低了NADP+含量(p<0.05)。

图4 BTH处理和B. cinerea接种对草莓果实贮藏期间NADPH(A)和NADP+(B)含量的影响Fig.4 The effects of BTH treatment and B. cinerea inoculation on contents of NADPH(A)and NADP+(B) in strawberries during the storage period

2.5 BTH处理和B. cinerea接种对草莓果实贮藏期间GSH、GSSG、AsA和DHA含量的影响

如图5可得,对照草莓果实中GSH含量在贮藏期间基本维持稳定,GSSG和DHA含量则呈现缓慢上升趋势,AsA含量在贮藏第1 d出现峰值,随后逐渐下降。经单一B.cinerea接种的果实中GSH和AsA含量在整个贮藏期间显著低于对照果实(p<0.05);同时,B.cinerea侵染在5 d的贮藏周期内均能显著促进果实中GSSG和DHA含量的上升(p<0.05),其中GSSG含量在贮藏期间显著高于对照果实(p<0.05),而DHA则仅在贮藏前4 d显著高于对照果实(p<0.05)。单一BTH处理和BTH+B.cinerea接种处理均能有效增加GSH和AsA含量，并抑制GSSG和DHA含量的上升,经BTH+B.cinerea接种处理的果实中GSH在贮藏后期(3～5 d)显著高于经单一BTH处理的果实(p<0.05)。

图5 BTH处理和B. cinerea接种对草莓果实贮藏期间GSH(A)、GSSG(B)、AsA(C)和DHA(D)含量的影响Fig.5 The effects of BTH treatment and B. cinerea inoculation on contents of GSH(A),GSSG(B),AsA(C)and DHA(D)in strawberries during the storage period

2.6 BTH处理和B. cinerea接种对草莓果实贮藏期间PRs基因表达丰度的影响

由图6可知,经单一B.cinerea接种的草莓果实PRs基因表达丰度在贮藏第1 d出现明显峰值,其数值分别是对照水平的1.67、3.89、1.56和1.65倍,随后迅速下降至对照水平。经单一BTH处理的草莓果实中PRs基因表达丰度在贮藏第1 d与对照相比无显著差异(p>0.05);但在贮藏第4、5 d,单一BTH处理显著诱导了果实PRs基因表达,使其丰度显著(p<0.05)高于对照果实。BTH复合B.cinerea接种较单一B.cinerea接种或BTH处理更能促进草莓果实PRs基因的表达丰度的提高,使果实中FaPR1、FaPR5、FaCHI-1和Faβglu基因表达丰度整个贮藏期间均显著(p<0.05)高于单一B.cinerea接种或BTH处理果实。

图6 BTH处理和B. cinerea接种对草莓果实贮藏期间FaPR1(A)、FaPR5(B)、FaCHI-1(C)和Faβglu(D)基因表达丰度的影响Fig.6 The effects of BTH treatment and B. cinerea inoculation on gene expression levels of FaPR1(A),FaPR5(B),FaCHI-1(C)and Faβglu(D)in strawberries during the storage period

3 讨论

与水杨酸(SA)的作用模式类似,BTH也被认为是一种高效激发子可直接激活植物超敏反应以形成SAR抗性[20]。最新研究表明,低浓度BTH处理诱导的植物Priming反应可在病原菌侵入时启动活性氧迸发、植保素合成以及PRs基因表达等一系列抗病性反应[21],以使植物免遭病原菌侵害。本研究经0.1 mmol/L BTH处理后,草莓果实中FaPR1、FaPR5、FaCHI-1和Faβglu等PRs基因表达量在贮藏前期无显著升高,贮藏后期草莓发病率逐渐上升,基因表达丰度也显著增加。果实先经BTH处理再接种病原菌B.cinerea后,其PRs基因丰度立即显著增加(p<0.05)并持续维持在较高水平。这说明，0.1 mmol/L BTH诱导的草莓果实抗病性反应是一种典型的Priming反应模式;通过该抗性模式,草莓果实可在遭受B.cinerea侵染时迅速启动防卫反应,激活PRs基因,从而控制灰霉病症状的进一步发展。这与前期研究结果类似,低浓度的BTH处理(0.01或0.1 mmol/L)可诱导葡萄果实的Priming反应,从而使果实在接种病原菌后迅速展现抗性[8]。

在诱导抗性网络中,提高植物内部还原势是激活植物防卫反应的重要步骤。对拟南芥WRKYs、GIPs和NPRs等转录因子的研究表明,在植物未受到病原菌侵染或激发子处理时,植物细胞中还原势较低,转录因子多以二硫键键合为共聚体的无活性形式存在;但当植物受到病原菌侵染开始启动防卫反应时,植物细胞内还原势急剧上升,从而将转录因子共聚体中的二硫键还原为巯基,释出具有活性的转录因子单体,最终诱导下游PRs基因的表达[22-24]。NADPH、GSH和AsA是植物细胞中主要的还原性物质,其含量的高低直接决定还原势[25]。PPP途径是植物糖代谢支路,其可将NADP+还原为NADPH,G6PDH和6PGDH是该途径的限速酶类[26];AsA-GSH循环可将GSSG和DHA还原为GSH和AsA,MDHAR、DHAR、GR和APX是该途径的关键酶类[27]。PR1基因是植物抗病性反应的特定标记基因,可直接反映防卫反应水平的高低;FaPR5基因是草莓与抗病相关的类甜蛋白的编码基因;FaCHI-1和Faβglu基因经表达后可合成几丁质酶和葡聚糖酶,水解真菌细胞壁[28]。在本研究中,B.cinerea侵染显著抑制了草莓果实PPP途径关键酶G6PDH和6PGDH活性以及AsA-GSH循环关键酶MDHAR、DHAR、GR和APX活性,从而导致还原性物质NAPDH、GSH和AsA逐渐氧化为NADP+、GSSG和DHA,同时果实中FaPR1、FaPR5、FaCHI-1和Faβglu基因表达丰度也显著下降。这说明草莓果实灰霉病的发展与果实内部还原势的降低密切相关;BTH可有效诱导草莓果实PPP途径和AsA-GSH循环关键酶活性的上升,提升NAPDH、GSH和AsA含量,提高果实还原势从而促进PRs基因表达,最终降低果实发病率。

4 结论

0.1 mmol/L BTH处理诱导草莓果实抗病性反应属于Priming模式,可使果实在接种B.cinerea病原菌后迅速展现抗性。BTH处理可诱导草莓果实还原性物质的积累,提高果实还原势,从而激活PRs基因,最终提高果实抗病性，抑制B.cinerea导致的灰霉病的发生。