周 婷,黄文权,谢加仕,张均伟,龚受基,4,*

(1.桂林医学院药学院,广西桂林 541004;2.钦州学院食品工程学院,广西钦州 535011;3.梧州中茶茶业有限公司,广西梧州543000;4.广西高校北部湾特色海产品资源开发与高值化利用重点实验室(钦州学院)，广西钦州 535011)

六堡茶属于黑茶,产于广西梧州六堡乡,历史悠久,其色泽黑褐光润,汤色红浓明亮,滋味醇和,香气醇陈,以“红、浓、陈、醇”四绝著称,具有清热利湿、分解油腻、降糖养神的功效。由于其独特的保健特性,六堡茶产品逐渐被消费者认可,拥有的市场份额增加,尤其在传统市场东南亚国家的知名度不断攀升。基于其市场价值和科研理论价值,六堡茶也渐渐进入了科学工作者的视野。六堡茶经过窖藏,茶叶中的其他多酚类物质发生氧化成分大幅下降,茶褐素却显著增加,显示出黑茶的独特品性。茶褐素是一种水溶性色素,被称为“黑茶中的黄金”,在改善糖脂代谢、防治糖尿病、减肥降脂、预防心血管疾病等方面效果显著,对改善人体的综合代谢平衡有着很大的帮助[1-3]。

普洱茶茶褐素的研究比较深入,主要集中在提取工艺、理化分析和功效等方面[4-5]。六堡茶茶褐素相关研究相对较少,在提取方法及工艺方面仅见大孔树脂纯化[6]及正交试验法的应用[3]。何英姿[3]等采用正交试验法对六堡茶茶褐素的提取工艺进行了优化,优化后的工艺为料液比1∶30,提取温度100 ℃、时间80 min。响应面分析法是一种实验条件寻优的方法,近年来在药物提取和处方工艺的优化方面应用较多,本实验应用该方法优化六堡茶茶褐素的提取工艺,比正交试验法更简化,更精确,其试验次数也较少[7],具有操作简单、精度高、预测性好等优点[8-9],并适用于多因素、多水平的试验。利用溶剂提取法对六堡茶茶褐素进行提取研究,并对茶褐素理化性能进行分析,以期阐明其化学组成及特征。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

六堡茶 梧州中茶茶业有限公司;考马斯亮兰G250、牛血清白蛋白(100 g,≥98%) 合肥博美生物科技有限责任公司;其他试剂 均为国产分析纯。

XS205电子分析天平 瑞士METTLER公司;80-台式离心机 上海精密仪器仪表有限公司;Epoch酶标仪 美国Bio-tek;RE-52AA旋转蒸发仪 郑州长城科工贸有限公司;SHB-IIIA循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司;UV-1800紫外可见光分光光度计 日本岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 六堡茶茶褐素的提取 准确称取5 g茶样,装入锥形瓶中,并加入蒸馏水,按照茶叶∶蒸馏水=1∶15～1∶55的料液比,将溶液加热到温度60～100 ℃,浸提40～120 min,溶液趁热抽滤(浸提中摇瓶2～5次),滤液减压浓缩至滤液的1/5～1/10,将上述浓缩液依次用2倍体积的氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取2、3、4次,将水层溶液倒入锥形瓶,添加无水乙醇使乙醇体积分数为80%[10],低温静置12 h后，在4500 r/min的条件下离心10 min,收集离心所得沉淀。以50 mL蒸馏水溶解离心管中的沉淀,充分溶解后，吸取溶液3 mL于25 mL容量瓶中,用蒸馏水定容。

1.2.2 单因素实验设计 将料液比、提取温度、提取时间作为单因素实验考察的主要因素,分别研究3个因素对茶褐素提取得率的影响。先固定料液比为1∶35 g/mL,提取时间为60 min,提取次数1次,提取温度分别取60、70、80、90、100 ℃;在确定提取温度为90 ℃的前提下,固定提取时间为60 min,提取次数1次,料液比分别取1∶15、1∶25、1∶35、1∶45、1∶55 g/mL;在确定料液比为1∶35 g/mL、提取温度为90 ℃较合适的前提下,提取次数为1次,分别设定提取时间为40、60、80、100、120 min。

1.2.3 Box-Behnken响应面分析法 在进行单因素实验的前提下,分别选取料液比、提取温度、提取时间作为主要影响因素,考察其对六堡茶茶褐素提取得率的影响。将提取得率作为因变量,建立三因素三水平的Box-Behnken响应面法,采用实验设计软件Design-Expert8.0.6进行数据处理,确定最佳提取工艺条件。

表1 Box-Behnken设计的因素与水平表Table 1 Factors and levels table of Box-Behnken design

1.2.4 六堡茶茶褐素对照品的制备 参考文献[10],称取10 g茶叶样品,装进索氏提取器,加100 mL 95%的乙醇提取,直至乙醇液颜色无色。茶渣用10倍量蒸馏水于烧瓶中提取3次,每次1 h,过滤并合并水提液,减压浓缩至20～30 mL,依次用2倍体积的三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取2、3、4次,每次振荡混合时间为3分钟,静置分层后放出水层待用。所得水相萃取液于55 ℃,真空度-0.09～-0.10条件下减压浓缩至20～30 mL左右。加无水乙醇至体积分数为80%,低温静置12 h,抽滤收集沉淀,得到该沉淀即为茶褐素对照品,沉淀在60 ℃条件下烘干待用。

取以上制备的茶褐素0.3 g,以100 mL蒸馏水充分搅拌,使其全部溶解。配制质量浓度为 0.18、0.24、0.30、0.48、0.6 mg/mL的茶褐素对照品溶液,蒸馏水为空白,精确吸取150 μL溶液注入96孔板,用酶标仪于270 nm波长下测定吸光值,每次做3个平行。以质量浓度(mg/mL)为横坐标、以吸光值为纵坐标进行线性分析,方程为Y=0.8451X+0.1408,相关系数R2=0.9995,质量浓度在 0.18～0.60 mg/mL范围内与吸光值间呈良好的线性关系。

1.2.5 茶褐素提取得率的测定 用酶标仪在270 nm下,蒸馏水为空白,以上述制备茶褐素对照品做标准[10],精确吸取150 μL溶液注入96孔板,测定溶液的吸光度,每次做3个平行,计算茶褐素提取得率。

式中,A为270 nm下测定的吸光值;n为稀释倍数;m为样品质量(g)。

1.2.6 六堡茶茶褐素理化成分分析 pH测定采用pH计法[11],取茶褐素样品配制成质量分数分别为0.1%、1%、5%的溶液,用pH计测定;总酸性基测定参照文献[5]操作;蛋白质测定采用考马斯亮蓝法[12-13];茶多糖测定采用蒽酮-硫酸法[14]。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 料液比对六堡茶茶褐素提取得率的影响 不同料液比对六堡茶茶褐素提取得率的影响如图1,料液比在1∶15～1∶35 g/mL时,提取得率呈上升趋势,而料液比在1∶35～1∶55 g/mL时，茶褐素提取得率下降。这是因为，随着溶剂的增多,茶叶与溶剂之间能充分接触,有利于茶褐素的溶出;当料液比增加到1∶35 g/mL时,茶褐素充分溶出,继续增加溶剂比例后,茶褐素的溶出受茶叶中其他成分的抑制反而不利于提取[15],考虑到过多提取溶剂的添加会增加浓缩的工作量,过少又会使茶褐素提取不完全而导致原料浪费,所以将料液比定为1∶35 g/mL比较合适。

图1 料液比对茶褐素提取得率的影响Fig.1 The effect of material-to-liquid ratio on yield of theabrownin

2.1.2 提取温度对六堡茶茶褐素提取得率的影响 温度对六堡茶茶褐素提取得率的影响如图2,提取温度在60～90 ℃时,随着提取温度的升高,茶褐素的提取得率明显增加;提取温度为90 ℃时，提取得率达到最高；超过90 ℃时,随着温度的升高,茶褐素提取得率呈下降趋势。考虑到升高温度,可能会破坏茶褐素的结构,影响其生物活性,故采用提取温度为90 ℃。

图2 提取温度对茶褐素提取得率的影响Fig.2 The effect of extraction temperature on yield of theabrownin

2.1.3 提取时间对六堡茶茶褐素提取得率的影响 提取时间对六堡茶茶褐素提取得率的影响如图3,提取时间的增加对提高六堡茶茶褐素提取得率的效果较为明显,在40～80 min范围内,随着提取时间的延长,茶褐素提取得率增加,提取时间超过80 min后,茶褐素提取得率基本恒定。考虑到提取时间延长,除茶褐素外的其他成分也会溶出,而且能耗增加,成本提高,故将提取时间定为80 min比较合适。

图3 提取时间对茶褐素提取得率的影响Fig.3 The effect of extraction time on yield of theabrownin

2.2 响应面法对茶褐素提取工艺的分析

根据Box-Behnken试验设计原理,在单因素试验基础上,选取料液比、温度、时间3个因素的合适水平,对提取工艺进行响应面分析,设计方案及结果见表2。

表2 Box-Behnken实验设计与结果Table 2 Design and results of Box-Behnken design

表3 回归方程方差分析表Table 3 Analysis of variance for the regression equation

固定一个变量于“0”水平,作另外2个变量与提取得率的响应面图见图4。由3组曲面响应面图比较结果可知，提取温度与提取时间的响应曲面图表现为最陡峭的曲面,因此这两个因素交互作用对茶褐素提取得率的影响最为显著;料液比与提取温度的响应曲面图表现为较陡峭的曲面,对茶褐素提取得率的影响较为显著;料液比与提取时间的响应曲面图表现为较平滑的曲面,对茶褐素提取得率的影响最小。通过Design-Expert 8.0.6实验软件分析,最优提取方案为:料液比1∶37.32 g/mL,提取温度95.89 ℃,提取时间85.67 min;理论预测值茶褐素提取得率为10.38%。为便利实际操作,将上述条件修正为:料液比1∶37 g/mL,提取温度96 ℃,提取时间86 min。

图4 各因素的交互作用对提取得率的响应面图Fig.4 Response surface plots of interaction of various factors on the yield of the abrownine

2.3 验证实验

为了验证响应面法优化六堡茶茶褐素提取工艺的有效性,在优化的提取条件下重复3次试验,以期考察实验结果与预测结果的吻合程度,实验结果表明茶褐素提取得率为10.33%±0.04%,而预测提取得率为10.38%,两者基本一致,说明回归方程与实际情况拟合很好,在茶褐素的提取工艺上具有一定的指导意义。采用溶剂提取法得到六堡茶褐素的提取得率为10.33%±0.04%,与文献[16]相比略高。六堡茶水溶性茶褐素易与蛋白质、茶多糖等高分子物质结合形成复合物,其含量高低可能取决于原料、工艺、陈化时间、提取工艺等因素,所以导致多个研究结果存在差异[5,16-18]。

2.4 六堡茶水溶性茶褐素的理化成分分析

六堡茶水溶性茶褐素中富含羧基、甲基、羟基、氨基,其酸碱性取决于酸碱基团的数目、电离常数。质量分数为5%、1%、0.1%的茶褐素溶液pH稍有差异,且浓度越小,pH越接近中性,浓度变稀,一方面电离常数变大使氢离子浓度有增大趋势,另一方面酸性基团数目减少使氢离子浓度有减少趋势,在这过程中可能酸性基团数目减少占优势,导致pH随茶褐素浓度减少而升高,但总体上茶褐素呈弱酸性,与文献[19]记载一致。茶褐素中总酸性基为(5.5±0.02) mmol·g-1,其中羧基(1.34±0.05) mmol·g-1,酚羟基(4.16±0.04) mmol·g-1,主要以酚羟基为主,占75.6%,六堡茶水溶性茶褐素的酸性贡献主要来源于酚羟基,结果与秦谊等[11]报道的一致。

表4 浓度与pH关系Table 4 Relationship of concentration and pH

表5 成分测定结果Table 5 Determination results of constituents

采用考马斯亮蓝法,以牛血清白蛋白做标准曲线,回归方程为Y=47.143X-0.5889(R2=0.9997),其中X为牛血清白蛋白含量,Y为溶液吸光度,测得六堡茶茶褐素中蛋白质的含量为(15.45±0.06)%,与文献相近[19]。

茶多糖的测定以麦芽糖为标准,回归方程为:Y=0.0714X+18.403(R2=0.9994),其中X为麦芽糖含量,Y为溶液吸光度,测得多糖含量为(25.16±0.11)%。茶多糖在茶褐素中比重较大,超过20%,其不但是茶汤呈甜味的主要物质基础[20],而且可能是生理活性的作用位点。

3 结论与讨论

在单因素考察结果的基础上，进行了响应面法研究,六堡茶茶褐素最佳提取方案为料液比1∶37 g/mL,提取温度96 ℃,提取时间86 min,理论预测茶褐素提取得率为10.38%,实际实验值为10.33%±0.04%。影响六堡茶茶褐素提取得率的各因素影响大小排列次序依次为提取温度>提取时间>料液比。

茶褐素提取得率除与厂家、原料、加工工艺、陈化时间、主观因素和测定方法等不同外,采用黄意欢的系统分析法测定数据时,六堡茶的茶褐素从19.31%～38.16%不等[21-22],普洱茶的茶褐素含量从7.23%～12.76%[23],雅安藏茶中茶褐素含量从3.20%～14.86%不等[24-25]。利用该测定方法测定30个典型普洱茶样品茶褐素含量,茶褐素含量范围在5.28%～9.73%之间,相对传统方法测定值7.36%～11.81%略低[10]。本文测定六堡茶茶褐素采用上述方法,茶褐素提取得率为10.33%±0.04%,与传统方法测定的茶褐素含量相近,而与该法测定的普洱茶茶褐素值略高,从理论和趋势上与上述文献吻合。利用响应面分析法对六堡茶茶褐素的提取进行研究,并对茶褐素的理化性能进行分析,发现其与普洱茶比较略有差异,六堡茶水溶性茶褐素的酚羟基占75.6%,普洱茶中酚羟基占88%,其三种浓度的平均pH为6.29,比六堡茶pH5.93略大[19],其原因可能与加工原料和加工工艺有关,导致其物质转化出现差异[26],但两者都具有黑茶的共同特征。