张艳军,廖日权,郑云云,尹艳镇,黄秋园,徐国鑫,黄恩交,朱靖清,吴彩丽

(钦州学院石油与化工学院,广西高校北部湾石油天然气资源有效利用重点实验室,广西钦州 535011)

火龙果(Pitaya)是仙人掌科,三角柱属植物[1]。火龙果花包含了人体必需的氨基酸、维生素、微量元素、膳食纤维、蛋白质、不饱和脂肪酸等多种营养成分,且其药用成分广泛,主要含黄酮、萜类、多酚类等活性物质[2-4]。火龙果花中特有的粘液,富含营养,具有较高药用价值,能起到抑菌、消炎、清火、润肺、止咳、增强免疫力、降血糖、降血脂、降血压、抗癌、治疗高尿酸症等作用[5-7]。

近年来,学者们对火龙果花的研究较多,主要涉及火龙果花的干制[8]、保健饮料的制作[9]、营养成分的研究等[2]方面。周俊良等[10]以脱水火龙果花为原料,研制出蜂蜜火龙果花茶饮料的最佳配比工艺,在此条件下该茶饮料的感官评价分数高,满足大众口味。高慧颖等[11]探讨超声波辅助提取火龙果花多糖的工艺条件,多糖抗氧化活性的结果显示，其具有较强的抗氧化活性。王琦等[12]探索了不同粉碎度、有机溶剂、温度以及提取时间对火龙果花精油提取率的影响,确立了火龙果花精油的最佳提取工艺条件。火龙果花因在药食两方面的广泛用途，具有较大的开发前景,而目前对火龙果花的体外抗氧化物提取工艺及抗炎活性的研究未见报道。

本文以火龙果花为研究对象,以乙醇为溶剂,先进行单因素实验,在此基础上采用正交试验进行火龙果花体外抗氧化物提取工艺优化,寻求最佳的提取工艺条件;并对最佳工艺条件下的粗提物进行了体外抗炎活性研究。该研究旨在为火龙果花的开发利用奠定基础和提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

火龙果干花 粉碎后过80目筛,至于干燥器中备用,广西钦州市火龙果基地,粉碎,过80目筛,备用;DPPH(即二苯代苦味酰肼)、VC、LPS(脂多糖)、胰酶、MTT(噻唑蓝) 美国Sigma公司;Hyclone DMEM培养基、血清 美国Gibco公司;RAW264.7小鼠巨噬细胞 中科院上海生命研究院;NO检测试剂盒(Griess试剂Ⅰ和Griess试剂Ⅱ) 碧云天生物技术有限公司;乙醇、FeSO4、水杨酸、过氧化氢等 均为分析纯。

T6型可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;FB214C型电子天平 上海精密科学仪器有限公司;M1000型多功能酶标仪 瑞士tecan公司;311型CO2培养箱 美国Thermo公司。

1.2 实验方法

1.2.1 提取工艺 准确称量火龙果花约2.0 g,在一定的温度、液料比和一定浓度的乙醇中，回流提取一定的时间,磁力搅拌辅助,回流完成后趁热抽滤,将滤液转移至100 mL容量瓶中,并用同浓度乙醇定容,得到的待测样品进行下一步的抗氧化活性测定。

1.2.2 单因素实验设计 提取温度对火龙果花提取物体外抗氧化活性的影响:预先设定料液比为1∶25 g/mL,乙醇浓度为75%,回流时间2 h,通过改变提取温度,分别设定为45、55、65、75、85 ℃五个水平，来探究提取温度对火龙果花提取液抗氧化活性的影响。料液比对火龙果花提取物体外抗氧化活性的影响:设定提取温度75 ℃,乙醇浓度为75%,回流时间2h,通过改变料液比,分别设定为1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 g/mL五个水平，来探究料液比对火龙果花提取液体外抗氧化活性的影响。提取时间对火龙果花提取物体外抗氧化活性的影响:设定温度75 ℃和液料比1∶30 g/mL,乙醇浓度为75%,通过改变回流时间,分别设定为1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h五个水平，来探究提取时间对火龙果花提取液抗氧化活性的影响。溶剂乙醇浓度对火龙果花提取物体外抗氧化活性的影响:设定温度75 ℃,液料比1∶30 g/mL和时间3.0 h,通过改变溶剂乙醇浓度,分别设定为60%、70%、80%、90%、100%五个水平来探究溶剂乙醇浓度对火龙果花提取液体外抗氧化活性的影响。

1.2.3 正交试验设计 根据火龙果花体外抗氧化活性单因素实验结果,对影响火龙果花抗氧化活性的四个因素(提取温度A,提取时间B,料液比C,乙醇浓度D)采用正交试验法优化提取工艺,采用L9(34)正交表进行试验,因素水平见表1。

表1 正交试验设计因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal test

1.2.4 体外抗氧化实验

1.2.4.1 DPPH自由基清除率的测定 参照文献[13],取待测样品各2 mL,分别加入2 mL 1.0×10-4mol/L DPPH,摇匀后暗室存放,30 min后,在517 nm测溶液的吸光值,并用空白液进行参比。每份样品平行测定3次取平均值。由所测得的吸光度值,计算出各待测样品对DPPH自由基的清除率K1,即用下式计算:

清除率K1(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100

式中:Ai-DPPH溶液和待测溶液吸光度;Aj-待测溶液和溶剂吸光度;A0-DPPH溶液和溶剂的吸光度。

1.2.4.2 OH自由基清除率的测定 参照文献[14],待测样品各2 mL,加入6 mmol/L硫酸亚铁2 ml,再加入6 mmol/L水杨酸-乙醇2 mL,最后加入6 mmol/L的过氧化氢溶液2 mL,摇匀后水浴37 ℃,0.5 h,在510 nm处测定吸光值A1。以等体积水代替水杨酸-乙醇溶液,测定吸光值A2,以扣除样品本身颜色干扰,以等体积水代替样品,为空白样,测定吸光值A0,每份样品平行测定3次,取平均值。由所测得的吸光度值,计算出各待测样品对OH自由基的清除率K2,即用下式计算:

清除率K2(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式中:A1-样品+硫酸亚铁+水杨酸-乙醇+过氧化氢的吸光度;A2-样品+硫酸亚铁+蒸馏水+过氧化氢的吸光度的吸光度;A0-蒸馏水+硫酸亚铁+水杨酸-乙醇+过氧化氢的吸光度。

1.2.4.3 样品对自由基的半清除浓度(IC50)测定 在最佳工艺条件下,回流提取样品后,将样品减压浓缩,置于真空干燥箱烘干。将样品配制成浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL,以不同浓度的VC为阳性对照，分别测定其对DPPH自由基与OH自由基的清除率,计算其半清除浓度。

1.2.5 体外抗炎活性测试

1.2.5.1 不同浓度样品对细胞活力影响 根据MTT法[15-16],选取了2.5、5.0、10.0、20.0 μg/mL四个浓度各10 mL,判断这四个剂量组以及100 ng/mL LPS(脂多糖)处理对巨噬细胞RAW264.7活力影响,设定未加药(加入DMEM培养基)正常组细胞活力为100%。

1.2.5.2 不同浓度样品对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞中NO含量的影响 利用griess法[17],将密度为2×106个/mL的RAW264.7巨噬细胞，以每孔180 μL均匀接种于96孔板中,细胞贴壁2 h后,每孔分别加入10 μL 2 μg/mL LPS,4 h后加入10 μL 2.5、5.0、10.0、20.0 μg/mL粗提物,设LPS对照和空白对照,每个浓度设4个复孔,培养24 h后取培养液上清于96 孔板中,按50 μL/孔,在各孔中室温加入Griess试剂Ⅰ和Griess 试剂Ⅱ,标准品用DMEM 稀释,浓度分别为0.00、1.56、3.12、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μmol/L,以10% DMEM加显色剂为空白对照,在540 nm酶标仪测定各孔吸光度值,以NaNO2为标准品,按标准曲线回归方程求出待测样品中NO浓度。

1.3 数据处理

采用Microsoft excel 2017,Origin Pro 8,SPSS 17.0进行数据处理,单因素试验和抗氧化、抗炎活性测定均重复3次,取平均值。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 提取温度对火龙果花提取物抗氧化活性的影响 由图1可知,提取温度对DPPH自由基及OH自由基的清除率都有着一定的影响,在温度为45～75 ℃时,提取液对DPPH自由基和OH自由基清除率随温度的上升而增加,但超过75 ℃后,清除率随温度的上升而减小,这可能是因为，过高的温度会使火龙果花中抗氧化活性成分多酚、花青素、多糖等的结构被破坏[18],从而使提取物对DPPH自由基和OH自由基的清除率减小。综上可知,75 ℃下提取时提取物对自由基的清除能力最强。

图1 提取温度对DPPH和OH自由基清除率的影响Fig.1 Effects of extracting temperature on the DPPH and OH radical-scavenging

2.1.2 料液比对火龙果花提取物抗氧化活性的影响 由图2可看出,样品和溶剂在不同的比例下,对DPPH自由基清除率及OH自由基的清除率影响也不同,且在料液比为1∶20～1∶30 g/mL范围内,清除率随料液比的增加而上升,这是由于，随着提取溶液的增多,样品在溶液中的分散程度增大,提取物与溶剂的接触面积增大,有利于火龙果花中抗氧化活性成分能充分溶出。但超过1∶30 g/mL后,清除率变化不大,这可能是由于达到一定的料液比时,火龙果花提取液中的抗氧化活性成分多糖、黄酮等基本溶解完全,溶剂量继续增加,抗氧化活性成也不会再有所增加,考虑到实验过程中原料的经济性与实验的效率,选定料液比在1∶30 g/mL为最佳。

图2 料液比对DPPH和OH自由基清除率的影响Fig.2 Effects of solid-liquid ratio on the DPPH and OH radical scavenging rate

2.1.3 提取时间对火龙果花提取物抗氧化活性的影响 由图3可知,在热回流法提取火龙果花体外抗氧化性的实验中,提取的时间对清除率有影响,且呈这样一个规律:提取时间1.0～3.0 h时,提取液对DPPH自由基和OH自由基的清除率都呈上升趋势,而超过3.0 h后,清除率呈下降趋势,这可能是因为，火龙果花提取液中的抗氧化活性成分在一定时间、温度下与溶剂充分接触，基本已经溶解完全,继续增加时间,反而会使得某些成分被破坏[19]。因此,提取时间设定在3.0 h,提取效果最佳,提取液清除自由基能力最强。

图3 提取时间对DPPH和OH自由基清除率的影响Fig.3 Effects of extracting time on the DPPH and OH radical scavenging rate

2.1.4 溶剂浓度对火龙果花提取物抗氧化活性的影响 由图4可知,提取溶剂的浓度对自由基的清除率影响趋势是:当乙醇浓度为60%～70%范围时,清除率呈逐渐上升的趋势,但当乙醇浓度继续增加时,提取液最自由基的清除率反而下降,这可能是由于高浓度的乙醇极性偏小,会使火龙果花中的蛋白、多糖等极性稍大的成分凝固而不能溶解,或者一些酚类不能被溶出[20],抗氧化活性成分的溶解度变低,导致提取物与对自由基的清除率能力下降。故设定70%的乙醇浓度为最佳条件。

图4 乙醇浓度对DPPH和OH自由基清除率的影响Fig.4 Effects of ethanol concentrationon the DPPH and OH radical scavenging rate

2.2 正交实验结果及验证

在单因素实验基础上,按L9(34)进行正交试验设计(见表2)。

表2 L9(34)正交试验设计及结果Table 2 L9(34)orthogonal test design and results

本实验研究了提取温度、提取时间、料液比以及乙醇浓度四个因素对火龙果花提取物体外抗氧化活性的影响,由正交实验的结果中极差分析得,影响火龙果花提取的因素主次顺序为D>C>A>B,即乙醇浓度对结果影响最大,其次是料液比,接着是提取温度,提取时间的影响最小。根据L9(34)正交实验确定出最佳提取工艺条件为A2B2C2D2,即提取温度为75 ℃、提取时间为3.0 h、料液比为1∶30 g/mL、溶剂乙醇浓度为70%,在最佳提取工艺下所测得的DPPH自由基清除率达到86.40%±1.07%,OH自由基的清除率达到83.50%±0.52%。

2.3 最佳提取工艺条件下样品对自由基的半清除浓度(IC50)

在最佳工艺条件下所得样品,由图5和图6可知,样品与VC对自由基的清除能力随着样品浓度的增加而增大,计算其对自由基的半清除浓度。结果表明:样品对DPPH自由基的清除曲线方程:y=185.17x-0.493,R2=0.9985,IC50值为0.273 mg/mL,VC对DPPH自由基:y=790.62x+17.12,R2=0.9974,IC50值为0.0416 mg/mL;样品对OH自由基的清除曲线方程:y=178.27x-0.132,R2=0.9974,IC50值为0.288 mg/mL。VC对OH自由基的清除曲线方程:y=140.94x-0.877,R2=0.9986,IC50值为0.361 mg/mL。综上所述,样品对DPPH自由基的清除率低于VC,而样品对OH自由基的清除率高于VC。

图5 样品浓度对DPPH自由基清除能力的影响Fig.5 Effect of sample concentration on DPPH· radical scavenging ability

图6 样品浓度OH自由基的清除能力的影响Fig.6 Effect of sample concentration on OH radical scavenging ability

2.4 最佳提取工艺条件下体外抗炎活性测定结果

2.4.1 不同浓度的样品对细胞活力的影响 由图7试验结果表明,与正常组相比,选取的四个剂量组以及LPS的加入对RAW264.7细胞活力也无显著差异(p>0.05)。证明在实验设置的药物剂量下,设定浓度的样品没有细胞毒性。

图7 粗提物浓度对细胞活力的影响Fig.7 Effect of extract concentration on cell viability注:a表示组间差异不显著(p>0.05,n=3)。

2.4.2 粗提物对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞中NO的作用 从图8中可见,相较于正常组,LPS作用后的RAW264.7巨噬细胞中NO含量极显著增大(p<0.01);相较于LPS组,粗提物可极显著抑制NO的释放(p<0.01),且浓度越大,化合物对LPS诱导RAW264.7细胞产生NO的抑制作用越强。表明化合物通过抑制NO的释放表现出来的抗炎活性与浓度呈正相关,具有剂量依赖性,得抑制率与样品浓度曲线方程:y=2.502x+15.15,R2=0.980(x为样品浓度，μg/mL；y对NO的抑制率，%),算得粗提物对NO的半抑制浓度IC50为13.94 μg/mL。

图8 粗提物浓度对细胞中NO的影响Fig.8 Effect extract concentration on NO in cell 注:不同大写字母表示组间差异极显著(p<0.01,n=3)。

3 结论

本实验对火龙果花粗提物体外抗氧化活性工艺及抗炎进行了初步探究。实验结果表明:在70%乙醇,1∶30 g/mL料液比,提取温度75 ℃,3.0 h热回流为最佳提取条件,此条件下粗提物对DPPH自由基的IC50值为0.273 mg/mL,OH自由基的IC50值为0.288 mg/mL。最佳工艺条件下提取物对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞产生的NO有很强的抑制作用,且与浓度呈正相关,具有剂量依赖性,其半抑制浓度IC50值为13.94 μg/mL,可见火龙果花具有较好的体外抗氧化和抗炎活性。有关资料显示火龙果花中含有丰富的多糖、黄酮和黄酮醇、三萜类化合物等活性物质[2,21],这些物质涉及抗氧化[11]、抗炎[22]等功效与本研究结果一致。该研究为拓宽火龙果花综合利用途径奠定基础和提供理论依据，为火龙果花的药用成分的进一步研究提供了一定的实验依据,为火龙果花资源的开发利用打下基础。