王玉婷,李存能,石鹏亮,张显忠,史仁玖,李艳玲

(泰山医学院生命科学学院,山东泰安 271016)

丹参是唇形科鼠尾草植物丹参(SalviamilitorrhizaBunge.)的干燥根茎[1]。在我国,云南和四川省的鼠尾草种数最多,而丹参在横断山区的种植较为丰富[2]。丹参具有抗肿瘤[3]、保护心血管系统[4]、抗炎[5]、抗氧化[6]等药理活性,是常用的活血化瘀中药之一。丹参的有效活性成分主要为脂溶性物质和水溶性物质两类。脂溶性物质以丹参酮型的二萜醌类化合物为主,主要有丹参酮ⅡA、隐丹参酮、二氢丹参酮Ⅰ、异丹参酮Ⅰ等;水溶性物质主要有丹参素、原儿茶醛、丹酚酸A、丹酚酸B等[7]。目前对丹参的研究主要集中在脂溶性丹参酮类和水溶性酚酸类物质,对丹参多糖的研究较少。药理研究表明,丹参多糖有提高免疫力[8]、抗氧化[9]、保护肝脏[10]等生物活性,因此具有良好的临床应用前景。但目前野生丹参资源严重匮缺,无法满足人们对丹参多糖的需求。

内生真菌(Endophyte fungi)是指在其生活史中的某一阶段或者全部阶段生活在植物组织、器官或者细胞间隙内,没有引起植物本身明显病害症状的真菌。近年来,研究表明，内生真菌能产生与宿主相同或相似的具有生理活性的次生代谢产物[11]。在前期工作中,课题组从泰山丹参中分离得到多株产具有抗氧化活性的内生真菌[12-13]。因此,本实验在前期研究工作的基础上,对内生镰刀菌HBG16产胞外多糖的发酵条件进行优化,并对其抗氧化能力进行分析,为真菌多糖的临床应用和工业化生产鉴定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

丹参镰刀菌HBG16菌株 由泰山医学院中药生物技术重点实验室分离保存;PDA液体培养基:马铃薯200 g,葡萄糖20 g,补足水分至1000 mL,自然pH,121 ℃灭菌20 min;PDA固体培养基:马铃薯200 g,葡萄糖20 g,琼脂20 g,补足水分至1000 mL,自然pH,121 ℃灭菌20 min;基础液体培养基:30 g葡萄糖,3 g NaNO3,0.5 g KCl,0.5 g MgSO4·7H2O,0.01 g FeSO4·7H2O,1 g K2HPO4·3H2O,定容至1000 mL,自然pH,121 ℃灭菌20 min;麦芽糖 生化试剂,上海蓝季科技发展有限公司;可溶性淀粉、尿素、葡萄糖、硝酸钠 均为分析纯,天津市凯通化学试剂有限公司;蛋白胨、酵母浸粉 均为生化试剂,北京奥博星生物技术有限责任公司;硫酸铵 分析纯,天津市博迪化工有限公司;氯化钾 分析纯,天津市广成化学试剂有限公司;硫酸镁 分析纯,天津市北方天医化学试剂厂;硫酸亚铁、蔗糖 均为分析纯,天津市永大化学试剂有限公司;磷酸氢二钾 分析纯;天津市巴斯夫化工有限公司;玉米粉、麸皮 食品级，市售。

V-5100型可见分光光度计 上海元析仪器有限公司;RE-2000型旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;TP-114型电子天平 丹佛仪器(北京)有限公司;BS-2F型数显振荡培养箱 上海梅香仪器有限公司;SW-CJ-1FD型净化工作台 上海新苗医疗器械制造有限公司;3-30K型高速台式冷冻离心机 德国Sigma离心机有限公司;OHpak SB-802.5HQ层析柱 岛津公司;ELEOS System凝胶渗透色谱仪 美国Wyatt技术公司。

1.2 实验方法

1.2.1 HBG16菌株的固体培养及种子液制备 取斜面保存的HBG16菌种转接到PDA固体培养基,28 ℃培养7 d,将长势良好的菌丝接到PDA平板,28 ℃培养7 d,用直径约70 mm的打孔器，在活化的HBG16平板上打孔,取2个菌饼接入装有100 mL PDA液体培养基的250 mL三角瓶中,置于转速为130 r/min,温度为28 ℃的摇床中培养3 d,作为种子液。

1.2.2 葡萄糖标准曲线的制作 采用苯酚-硫酸法测定葡萄糖的浓度,制备葡萄糖标准曲线[13]。将葡萄糖置于105 ℃烘箱中,烘干至恒重,称取葡萄糖1.000 g于100 mL容量瓶中,定容,摇匀,即为葡萄糖储备液。吸取10 mL葡萄糖储备液于100 mL容量瓶中,定容,摇匀,即为葡萄糖标准液。取5支试管,用移液枪分别加入0.08、0.16、0.24、0.32、0.40 mL的葡萄糖标准液,并用蒸馏水补足至2 mL,在每支试管中分别加入1 mL 5%苯酚和5 mL浓硫酸,混匀,静置30 min,以加入2 mL蒸馏水的反应液为空白对照调零,测定490 nm下的吸光度值,以葡萄糖浓度为横坐标,以吸光度值为纵坐标,绘制葡萄糖标准曲线,如图1。

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 Standard curve of glucose

1.2.3 HBG16胞外多糖产量的测定 将种子液接种于基础培养基中,置于转速为130 r/min,温度为28 ℃的摇床中培养7 d,发酵液经抽滤,去除菌丝体,将滤液于60 ℃下旋蒸浓缩至原体积的1/3,加入三倍体积的95%乙醇,4 ℃下静置过夜,经6000 r/min,15 min离心,取沉淀,于60 ℃烘箱内烘干至恒重,即为胞外多糖。精确称量胞外多糖的质量,研磨后,称取20 mg胞外多糖,加蒸馏水定容至100 mL,用移液管吸取2 mL于试管中,加入1 mL 5%苯酚溶液和5 mL浓硫酸,摇匀静置30 min,于490 nm下测量胞外多糖的吸光度值,并根据标准曲线进行换算。

1.2.4 HBG16产胞外多糖发酵条件优化

1.2.4.1 单因素实验 参考李传民[14]的方法,以3 g/L NaNO3为唯一氮源,分别以30 g/L的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、玉米粉、麸皮为碳源,保持原发酵液pH,接种量为10%,130 r/min、28 ℃,培养7 d,检测胞外多糖的产量,确定最佳碳源。

在上述试验的基础上,以30 g/L麦芽糖为唯一碳源,分别以3 g/L硝酸钠、尿素、胰蛋白胨、硫酸铵、酵母粉为氮源,保持原发酵液pH,接种量为10%,130 r/min、28 ℃,培养7 d,检测胞外多糖的产量,确定最佳氮源。

在上述试验的基础上,以30 g/L麦芽糖为碳源,3 g/L酵母粉为氮源,用NaOH溶液和稀硫酸调整液体培养基的pH分别为5.0、6.0、7.0、8.0,130 r/min、28 ℃,培养7 d,检测胞外多糖的产量,确定液体培养基的最佳pH。

在上述试验的基础上,分别以30 g/L麦芽糖为碳源,3 g/L酵母粉为氮源,培养基pH6.0,以2%、6%、10%、15%、20%的接种量,接入装有100 mL液体培养基的250 mL三角瓶中,130 r/min、28 ℃,培养7 d,检测胞外多糖的产量,确定最佳接种量。

1.2.4.2 响应面优化试验 依据单因素实验结果,利用Box-Behnken试验原理,选择碳源、氮源、接种量、pH四个水平,设计四因素三水平响应面试验,Box-Behnken实验设计与分析因素及水平设计见表1。并利用Design-Expert软件对每个因素下产生的数据进行二次回归拟合,以此求得产胞外多糖的丹参内生镰刀菌HBG16的最佳发酵条件。利用最佳发酵条件进行验证实验，测量多糖产量和菌丝干重，做三组平行实验，取平均值。

表1 Box-Behnken实验因素与水平表Table 1 Factors and levels table of Box-Behnken experiment

1.2.5 HBG16胞外多糖的单糖组成分析 采用凝胶渗透色谱法(GPC)进行样品单糖组成分析。前处理:称取一定量的硝酸钠溶于蒸馏水并稀释至1 L,配制成0.2 mol/L的NaNO3溶液,过0.22 μm孔径滤膜,50 Hz,超声脱气15 min。称取一定量的样品溶于流动相中,定容至100 mL。移取此溶液10 mL,用流动相稀释并定容至50 mL,过膜,上机。检测条件:色谱柱:OHpak SB-802.5HQ;进样量:20 μL;柱温:25 ℃;流动相:NaNO3溶液;流速:0.500 mL/min;检测器:示差检测器(DRI)。

(2)加强管理。目前，煤炭建设项目在控制和激励体制方面还不够完善。由于控制不足，导致设计方案和工程造价质量不高，因此，需要建立健全一套严格的标准来控制其质量。另外，还需要有良好的激励制度，以调动设计人员和造价人员的工作积极性，达到有效控制工程造价的目的。

1.2.6 HBG16胞外多糖的体外抗氧化活性测定 采用DPPH法[15]对胞外多糖的体外抗氧化活性进行评价。吸取不同浓度的样品溶液3.0 mL,分别加入2.0 mL 0.2 mmol/L DPPH·溶液,摇匀后避光放置30 min。以2.0 mL蒸馏水与2.0 mL无水乙醇的混合溶液为对照,用分光光度计分别测定上述溶液在517 nm处的吸光度值Ai,以相同浓度的VC做对照。吸取不同浓度的样品溶液3.0 mL,分别加入2.0 mL蒸馏水,混合均匀,以蒸馏水为对照,用分光光度计分别测定各混合液在517 nm处的吸光度值Aj,以相同浓度的VC溶液做对照。吸取2 mL 0.2 mmol/L DPPH·溶液,加入2 mL蒸馏水混合均匀,以2 mL蒸馏水与2 mL无水乙醇的混合溶液为对照,用分光光度计测定上述溶液在517 nm处吸光度值A0。按下式计算DPPH·清除率。

DPPH·清除率(%)=[(A0-Ai+Aj)/A0]×100

式中，Ai为样品溶液和VC溶液与DPPH·溶液混合后在波长517 nm处的吸光度值;Aj为样品溶液和VC溶液与等体积溶剂混合后在517 nm处的吸光度值;A0为DPPH·溶液与等体积溶剂混合后在517 nm处的吸光度值。

清除率为50%时,所需抗氧化剂的浓度即为半数抑制率IC50值(mg/mL)。

2 结果与分析

2.1 HBG16产胞外多糖发酵条件的单因素实验结果

2.1.1 碳源对胞外多糖产量的影响 由图2可知,以麦芽糖为碳源时,多糖产量最高,蔗糖、葡萄糖、玉米粉差异较小,利用麸皮作为碳源,多糖产量最低,以此确定最佳碳源为麦芽糖,出现这种现象的原因可能是当碳源为30 g/L时,丹参内生镰刀菌HBG16对麦芽糖的转化利用率较高[14]。

图2 碳源对胞外多糖产量的影响Fig.2 Effect of carbon sources on theproduction of extracellular polysaccharide注:图中不同小写字母表示差异显著(p<0.05),下同。

2.1.2 氮源对胞外多糖产量的影响 由图3可知,以酵母粉为氮源时,多糖产量最高,以尿素、硝酸钠、胰化蛋白胨、硫酸铵为氮源时,多糖产量差异不显著(p>0.05)。原因可能是当氮源为3 g/L时,镰刀菌HBG16对酵母粉的转化率更高[16]。

图3 氮源对胞外多糖产量的影响Fig.3 Effect of nitrogen sources on theproduction of extracellular polysaccharide

2.1.3 pH对胞外多糖产量的影响 由图4可知,当pH5.0和pH6.0时,内生镰刀菌HBG16胞外多糖产量均较高。在pH6.0之后,随pH增加,HBG16多糖产量减少。说明丹参内生镰刀菌HBG16在弱酸条件下,胞外多糖的产量比中性及弱碱条件下更高[17]。

图4 pH对胞外多糖产量的影响Fig.4 Effect of pH on theproduction of extracellular polysaccharide

图5 接种量对胞外多糖产量的影响Fig.5 Effect of inoculum amout on theproduction of extracellular polysaccharide

2.2 响应面法对丹参内生镰刀菌HBG16胞外多糖产量的优化

2.2.1 根据Box-Behnken实验原理,以丹参内生镰刀菌HBG16胞外多糖产量为响应值,设计四因素三水平的响应面实验,实验设计方案及结果如表2所示。利用Design-Expert软件对每个因素下产生的数据进行二次回归拟合。得到丹参内生镰刀菌HBZ16胞外多糖产量(Y)对麦芽糖(A)、酵母粉(B)、接种量(C)、pH(D)的二次回归多项方程为:

表2 Box-Behnken实验设计及结果Table 2 Design and results of Box-Behnken

Y=0.95+0.11A-0.082B+0.008083C+0.011D-0.14AB+0.12AC+0.017AD-0.00375BC+0.00075BD-0.02CD-0.32A2-0.3B2-0.36C2-0.38D2

表3 回归模型方差分析结果Table 3 Variance analysis of regression equatio

2.2.2 因素间交互作用的影响 图6响应面的等高线为椭圆形,坡度较陡,说明麦芽糖和酵母粉交互作用强,对于胞外多糖产量的影响较大;同时麦芽糖对应的曲面相对于酵母粉而言较陡,说明麦芽糖对胞外多糖产量的影响要大于酵母粉。图7响应面的等高线为椭圆形,坡度较陡,说明麦芽糖和接种量交互作用强,对于胞外多糖产量的影响较大;同时麦芽糖对应的曲面相对于接种量而言较陡,说明麦芽糖对胞外多糖产量的影响要大于接种量。图8 响应面的等高线为近似于圆形的椭圆形,坡度较缓,说明麦芽糖和pH交互作用不强,对于胞外多糖产量的影响较小;同时麦芽糖对应的曲面相对于pH而言较陡,说明麦芽糖对胞外多糖产量的影响要大于pH。图9响应面的等高线为近似于圆形的椭圆形,坡度较缓,说明接种量和酵母粉交互作用不强,对于胞外多糖产量的影响较小;同时酵母粉对应的曲面相对于接种量而言较陡,说明酵母粉对胞外多糖产量的影响要大于接种量。图10响应面的等高线为近似于圆形的椭圆形,坡度较缓,说明接pH和酵母粉交互作用不强,对于胞外多糖产量的影响较小;同时酵母粉对应的曲面相对于pH而言较陡,说明酵母粉对胞外多糖产量的影响要大于pH。图11响应面的等高线为近似于圆形的椭圆形,坡度较缓,说明接种量和pH交互作用不强,对于胞外多糖产量的影响较小;同时pH对应的曲面相对于接种量而言较陡,说明pH对胞外多糖产量的影响要大于接种量。

图6 麦芽糖和酵母粉的交互作用及对多糖产量的影响Fig.6 The response surface analysis chart of maltose and yeast powder

图7 麦芽糖和接种量的交互作用及对多糖产量的影响Fig.7 The response surface analysis chart of maltose and inoculums size

图8 麦芽糖和pH的交互作用及对多糖产量的影响Fig.8 The response surface analysis chart of interaction of maltose and pH

图9 接种量和酵母粉的交互作用及对多糖产量的影响Fig.9 The response surface analysis chart of interaction of inculum amout and yeast powder

图10 pH和酵母粉的交互作用及对多糖产量的影响Fig.10 The response surface analysischart of interaction of pH and yeast powder

图11 pH和接种量的交互作用及对多糖产量的影响Fig.11 The response surface analysischart of interaction of pH and inoculum amout

2.2.3 丹参内生镰刀菌HBG16培养条件优化及验证 通过对回归模型进行分析,得出镰刀菌HBG16的最佳培养条件为麦芽糖32.2 mg/mL,酵母粉2.62 mg/mL,接种量为6.2%,pH为6.0,模型预测值0.97 mg/mL,考虑到实际操作的可行性,对最佳培养条件进行修正,麦芽糖32 mg/mL、酵母粉2.6 mg/mL、接种量为6%、pH为6.0,以此条件进行验证实验,得到HBG16胞外多糖产量、菌丝干重随培养时间的动态变化,如图12。结果表明,在第1 d时,HBG16胞外多糖产量最高,主要是由于麦芽糖未被HBG16充分吸收利用,此时测得的结果应主要为培养基中麦芽糖在苯酚-硫酸反应中的结果,而胞外多糖含量较少,在第7 d得到多糖产量0.95 mg/mL,模型预测值0.97 mg/mL,与预测值的偏差为2.06%,说明该模型拟合度良好。

图12 胞外多糖产量、菌丝干重动态变化Fig.12 Dynamic changes of pplysaccharideyield and mycelial dry weight

2.3 HBG16胞外多糖的单糖组成分析

凝胶柱色谱利用分子筛的分离原理,样品进入色谱柱后，在流动相的带动下，按照分子量由大到小的顺序流出色谱柱。本实验分别以甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、核糖、岩藻糖为标准品作对照，进行单糖组分分析,结果表明胞外多糖的单糖组成主要是半乳糖,其含量为52.09 mg/kg。

2.4 HBG16胞外多糖对DPPH·的清除作用

图13表明,在实验浓度范围内,随着浓度上升,多糖对DPPH自由基清除率增大,当胞外多糖浓度为1.0 mg/mL时，清除率为87.85%,VC清除率随VC浓度增加而增加,结果表明,胞外多糖对DPPH清除率与VC相比略低,但胞外多糖浓度越高,清除率越高,胞外多糖的IC50值为0.38 mg/mL。

图13 胞外多糖对DPPH自由基清除作用Fig.13 Scaveging effect of polysaccharide on DPPH radicals

3 结论

本研究采用单因素实验分析了麦芽糖、酵母粉、接种量、pH对丹参内生真菌胞外多糖产量的影响,在此基础上,通过Box-Behnken响应面试验确定了HBG16胞外多糖产生的最佳培养条件为麦芽糖32 mg/mL,酵母粉2.6 mg/mL,pH为6.0,接种量为6%。这四个因素对HBG16胞外多糖产量的影响顺序依次为麦芽糖>酵母粉>pH>接种量。在该优化条件下进行验证实验,多糖产量为0.95 mg/mL,与预测值偏差较小,充分证明了方法的可靠性,可应用于丹参内生镰刀菌HBG16液体发酵生产胞外多糖。清除DPPH自由基实验表明，丹参内生镰刀菌HBG16胞外多糖具有一定的抗氧化能力,研究结果为丹参内生真菌胞外多糖的开发利用和工业化生产奠定基础。