朱瑞瑜,陈水铝,黄聪辉,楼芳菲,尤玉如,马莉莉

(1.浙江科技学院生物与化学工程学院,浙江杭州 310023;2.浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室,浙江杭州 310023;3.Coalescence,LLC,美国俄亥俄州 43219)

据美国农业部(USDA)官网2017年的报道,全世界每年大约有25%的农作物受到真菌毒素的污染;真菌毒素污染成为我国农产品出口欧盟的最大阻碍[1-2]。棒曲霉素是自然界中一种常见的真菌毒素,广泛存在于水果、蔬菜、谷物、海鲜、坚果及其制品中。棒曲霉素对细菌、酵母、植物、哺乳动物以及人类均有毒害作用[3]。短时间内大量摄入棒曲霉素会引起急性中毒,表现为恶心、呕吐,肠胃功能紊乱、膀胱和肝脏等器官病变等;慢性中毒包括诱发肿瘤、致癌、致畸及潜在的遗传毒性等[4-6]。虽然各国家和地区设立了棒曲霉素在食品中的限量标准,但棒曲霉素的污染依然较为普遍。2017年中国的一次抽检结果显示,在由果汁、果干、果酱组成的137个样品中,棒曲霉素的检出率为31%,超标率为17.5%[7]。

微生物法被认为是一种有效去除棒曲霉素的方法之一。近几年来,已分离得到多种可去除棒曲霉素的菌株,比如Candidaguilliermondii[8]、Sporobolomycessp[9]、Rhodosporidiumpaludigenum[10]、Rhizopusisolates[11]以及Pichiacaribbica[12]等。然而,这些已报道的微生物中,绝大多数并非食品生产用微生物,因而无法直接应用到食品中。

本文研究了食品生产用微生物SaccharomycescerevisiaeKD对棒曲霉素的去除作用,并将其应用到被棒曲霉素污染的市售100%苹果汁中,发酵2 d后对发酵苹果汁的品质进行了评价,以期为降低果汁中棒曲霉素的污染提供新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

商业化葡萄酒酿造菌株(SaccharomycescerevisiaeVitilevure KD) 法国Martin Vialatte;乳酸乳球菌(Lactococcuslactissubsp.cremorisMG1363) 德国MoBiTec;氢氧化钠、没食子酸、福林酚、碳酸钠、亚硝酸钠、酚酞指示剂 国药集团化学试剂有限公司;抗坏血酸(>99.0%)、无水乙醇、乙酸乙酯、冰醋酸、醋酸钠 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;NYDB液体培养基(8 g牛肉浸膏、5 g酵母浸出粉和10 g葡萄糖溶于1 L蒸馏水);MRS培养基 杭州微生物试剂有限公司;100%苹果汁 北京汇源食品饮料有限公司。

Waters 2695液相制备色谱 美国Waters;SpectraMax M3多功能酶标仪 美国Molecular Devices;NDK-12W水浴氮吹仪 上海皓庄(LNB)仪器有限公司;SW-CJ-1FD净化工作台 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;LDZF-50KB立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂司;BSP-250生化培养箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;BS-IEA振荡培养箱 国华电器有限公司;手持折光仪 上海仪电物理光学仪器有限公司;Milli-Q Academic超纯水仪 美国Milli-pore公司。

1.2 实验方法

1.2.1S.cerevisiaeKD对棒曲霉素的去除作用 将活化两代的S.cerevisiaeKD接种于无菌NYDB液体培养基中,使其菌体起始浓度为107CFU/mL,同时加入棒曲霉素,使培养基中棒曲霉素浓度分别为0、1 mg/L(0为对照组)。将样品置于28 ℃、150 r/min的摇床中培养,分别在培养12、16、20、24、28 h后,离心取上清液,检测培养液中棒曲霉素的含量。

1.2.2 灭活和活体S.cerevisiaeKD菌体对棒曲霉素的去除作用 在28 ℃、150 r/min振荡条件下大量培养S.cerevisiaeKD,48 h后将菌液等量分成两组,其中一组于85 ℃水浴30 min,灭活酵母;另一组不做任何处理。分别向两组菌液以及无菌NYDB培养基(作为对照)中加入等量的棒曲霉素,使得体系中棒曲霉素浓度为5 mg/L。将上述处理置于28 ℃、150 r/min振荡培养,培养1、3 d后分别检测菌液中棒曲霉素的残留量。

1.2.3 棒曲霉素起始浓度和菌体起始浓度对S.cerevisiaeKD去除棒曲霉素的影响 向无菌NYDB液体培养基中加入棒曲霉素,使得棒曲霉素起始浓度分别为1、10、30、50 mg/L;将S.cerevisiaeKD接种到上述培养基中,接种量为107CFU/mL;以含等量棒曲霉素但不含S.cerevisiaeKD的培养基作为对照。将样品置于28 ℃、150 r/min的摇床中培养,分别在培养12、24、36 h后，检测培养液中棒曲霉素的含量。

将S.cerevisiaeKD接种到NYDB液体培养基中,起始接种量分别为0、105、106、107CFU/mL(0为对照组);向上述培养基中加入棒曲霉素,使其起始浓度为5 mg/L。将样品置于28 ℃、150 r/min的摇床中培养,分别在培养6、12、24、36 h后，检测培养液中棒曲霉素的含量。

1.2.4 培养基pH对S.cerevisiaeKD去除棒曲霉素的影响 用NaOH溶液(1 mol/L)和HCl溶液(1 mol/L)将NYDB培养基的pH分别调至4.0、5.0、6.0、7.0。将活化好的S.cerevisiaeKD分别接种到上述不同pH的培养基中,接种量为0、107CFU/mL(0为对照),培养基中棒曲霉素起始浓度为5 mg/L。将96孔板置于28 ℃恒温培养箱中培养48 h,每隔3 h测定菌体吸光值(OD600),并分别在12、24、36、48 h检测培养液中棒曲霉素的含量。

1.2.5S.cerevisiaeKD对棒曲霉素的耐受力 将活化两代的S.cerevisiaeKD接种到含NYDB培养基的96孔板中,使得培养基中起始菌体浓度为107CFU/mL,棒曲霉素的起始浓度分别为0、3、5、10、50、100 mg/L。将96孔板置于28 ℃恒温培养箱中培养33 h,每隔3 h测定菌体吸光值(OD600)。

1.2.6S.cerevisiae和L.lactis对苹果汁中棒曲霉素的去除作用及发酵果汁的品质评估 本课题组前期研究发现,L.lactisMG1363能够有效去除液体中的棒曲霉素(数据未显示)。将S.cerevisiae和L.lactis混合接种于市售100%苹果汁中(棒曲霉素起始浓度为5 mg/L),并设置不同的处理对苹果汁进行发酵。处理一:两菌株初始浓度均为5×106CFU/mL,样品置于33 ℃、120 r/min的摇床中培养48 h;处理二:5×106CFU/mL的S.cerevisiae置于28 ℃、120 r/min的摇床中培养24 h后,加入5×106CFU/mL的L.lactis,样品置于33 ℃、120 r/min的摇床中继续培养24 h;处理三与处理二相同,但全程均为静置培养;处理四:两菌株起始浓度均为5×106CFU/mL,样品置于33 ℃、120 r/min的摇床中培养24 h后,继续静置培养24 h。除了处理三外,其余样品在培养前均添加9%蔗糖。培养结束后,对样品中棒曲霉素的残留量进行了测定,并对发酵苹果汁的品质进行了评估,主要检测了样品中的可溶性固形物、酸度、黄酮和总酚的含量。

1.2.7 指标测定方法

1.2.7.1 发酵后苹果汁品质指标测定 利用手持折光仪检测可溶性固形物;总酸的测定参考国标GB/T 12456-2008[13]的方法进行,最后结果以苹果酸表示(苹果酸换算系数为0.067);总酚的检测参照国标GB/T 31740.2-2015[14]的方法进行;黄酮含量的检测参照郑亚美等[15]的方法进行。设置未经任何处理的市售100%纯苹果汁作为对照。

1.2.7.2 棒曲霉素的提取与检测 棒曲霉素的提取方法:向待测溶液中加入等体积乙酸乙酯,于180 r/min小摇床中震摇 3 h后,于3000 r/min转速下离心3 min,收集有机相并于40 ℃水浴下进行氮吹,用AABS缓冲液(0.45 mL冰醋酸、0.15 g醋酸钠溶解于40 mL双蒸水中,调整pH至4.0)溶解、过滤,待用。

棒曲霉素含量检测参考Zhu等[16]的方法并进行适当修改:采用高效液相色谱系统,选取C-18反向色谱柱(Phenomenex 250×4.6 mm,5 μm,USA),流动相为水(0.04%乙酸,v/v)和乙腈90∶10(v/v),流速1 mL/min。检测波长为276 nm,柱温恒定为35 ℃,进样量为20 μL。

棒曲霉素去除率(%)=(对照组棒曲霉素含量-处理组棒曲霉素含量)/对照组棒曲霉素含量×100

通过绘制标准曲线获得的棒曲霉素含量计算公式如下:

x=(y+605.71)/135.87,R2=0.9999;其中,x为棒曲霉素含量(μg/L),y为峰面积。

1.3 数据处理

测定菌体吸光值实验中每个处理设置6个平行,其他实验中每个处理设置3个平行,每组实验重复3次。采用SPSS软件22.0进行数据分析;采用ANOVA进行邓肯氏差异分析(p<0.05)。

2 结果与分析

2.1 S. cerevisiae KD对棒曲霉素的去除作用

2.1.1S.cerevisiaeKD在NYDB培养基中对棒曲霉素的去除作用S.cerevisiaeKD可以有效降低培养基中棒曲霉素的含量,结果如表1所示。有氧培养12 h后,S.cerevisiaeKD对棒曲霉素的去除率为74.9%;培养28 h后，培养基中已检测不到棒曲霉素。Moss等[17]利用S.cerevisiae71B降解棒曲霉素,发现在有氧条件下培养100 h后,棒曲霉素含量只减少了约20%。因此,本研究中选用的S.cerevisiaeKD在有氧条件下，可高效去除培养基中的棒曲霉素。为探寻S.cerevisiaeKD去除棒曲霉素的机理,本研究比较了灭活酵母和活体酵母对棒曲霉素含量的影响,结果如图1所示。

表1 S. cerevisiae KD在NYDB培养基中对棒曲霉素的去除率Table 1 Patulin reduction rate by S. cerevisiaeKD in NYDB medium

2.1.2 灭活和活体S.cerevisiaeKD菌体对棒曲霉素的去除作用 由图1可知,灭活酵母可降低溶液中棒曲霉素的含量,由此推断S.cerevisiaeKD对棒曲霉素有物理吸附作用。在相同的培养条件下,活体酵母对棒曲霉素的去除率明显高于灭活酵母:培养1 d时,活体酵母对棒曲霉素的去除率为79.35%,而灭活酵母去除率仅为21.92%;培养3 d后,活体酵母去除率达到97.82%,灭活酵母去除率没有显著变化(p>0.05)。此外,S.cerevisiaeKD在本实验前期已培养了48 h,达到了稳定期,酵母菌体不再进行数量上的增长,但随着培养天数的增加，活体酵母组的棒曲霉素浓度出现了显著的下降(p<0.05),从而推断S.cerevisiaeKD可以酶解棒曲霉素。由此可知,S.cerevisiaeKD既能物理吸附棒曲霉素,又能生物降解棒曲霉素。酵母细胞壁中的蛋白质与多糖和菌体吸附棒曲霉素紧密相关,而菌体表面的疏水作用在吸附棒曲霉素的过程中，也发挥着至关重要的作用[18]。虽然目前已证实，不少微生物可以生物酶解棒曲霉素,然而迄今为止,尚未有报道分离纯化得到微生物降解棒曲霉素的相关酶类[9,16]。

图1 灭活和活体S. cerevisiae KD菌体对棒曲霉素的去除作用(NYDB培养基中)Fig.1 Patulin reduction by inactivated and viable cells of S. cerevisiae KD in NYDB medium注:“*”表示同一处理下3 d与1 d的降解率相比有显著差异(p<0.05)。

2.1.3 棒曲霉素起始浓度和菌体起始浓度对S.cerevisiaeKD去除棒曲霉素的影响 棒曲霉素起始浓度对S.cerevisiaeKD去除棒曲霉素的影响如图2所示,当棒曲霉素浓度高达50 mg/L,S.cerevisiae依然可有效去除棒曲霉素。培养24 h后,棒曲霉素浓度为1、10、30、50 mg/L处理组的去除率分别为93.8%、83.7%、65.7%和58.4%。S.cerevisiaeKD对棒曲霉素的去除率随起始棒曲霉素浓度升高而降低,这和棒曲霉素对酵母有毒性相关[3]。

图2 棒曲霉素起始浓度对S. cerevisiae KD去除棒曲霉素效率的影响(NYDB培养基中)Fig.2 Influence of initial patulin concentration on patulin reduction efficiency by S. cerevisiae KD in NYDB medium

酵母起始浓度越高,在初始阶段对棒曲霉素的去除效率越高(图3)。当S.cerevisiaeKD浓度为106、107CFU/mL时,其对棒曲霉素的去除率明显高于酵母浓度为105CFU/mL的处理组。但当培养时间达到36 h时,各组棒曲霉素的去除率均趋于100%。随着菌体的生长和对棒曲霉素环境的适应,在培养后期较高的菌体起始浓度处理组不一定在棒曲霉素降解能力上呈现优势。Cao等[19]发现,当酵母起始浓度为109CFU/mL 时,培养15 d后其降解效果低于起始浓度为5×108CFU/mL的处理组。

图3 酵母起始浓度对S. cerevisiae KD去除棒曲霉素效率的影响(NYDB培养基中)Fig.3 Influence of initial yeast concentration on patulin reduction efficiency by S. cerevisiae KD in NYDB medium

2.1.4 培养基pH对S.cerevisiaeKD去除棒曲霉素的影响 由图4可知,当起始pH在4.0～6.0之间时,S.cerevisiae对棒曲霉素有较好的去除效果。而不同pH下菌株的生长曲线(图5)表明,S.cerevisiae在pH为5.0和6.0的培养基中时,生长状态较佳,由此可见,菌体去除棒曲霉素的能力和生长状态有相关性。

图4 NYDB培养基pH对S. cerevisiae KD去除棒曲霉素效率的影响Fig.4 Influence of pH value on patulin reduction efficiency by S. cerevisiae KD in NYDB medium

图5 NYDB培养基pH对S. cerevisiae KD生长的影响Fig.5 Influence of pH value on the growth of S. cerevisiae KD in NYDB medium

2.2 S. cerevisiae KD对棒曲霉素的耐受力

不同浓度的棒曲霉素对S.cerevisiaeKD生长的影响如图6所示。当棒曲霉素浓度在3～100 mg/L范围内,S.cerevisiaeKD均能生长。在低棒曲霉素浓度(0～5 mg/L)下,菌体的生长并未受到明显的影响。当培养基中棒曲霉素的浓度为10 mg/L时,菌体的生长受到轻微抑制。据报道,棒曲霉素能破坏细胞膜和蛋白质结构的完整性,对酵母产生毒害作用,当棒曲霉素浓度为8 mg/L 时,能完全抑制酵母Schizosaccharomycespombe的生长[20]。而在本实验中,当棒曲霉素浓度低于10 mg/L时,S.cerevisiaeKD的生长并未受到明显影响;当棒曲霉素浓度高至50 mg/L时,菌体的生长受到明显抑制。然而,菌体在棒曲霉素浓度高达100 mg/L时依然能生长。因此推测,菌体可能通过降解棒曲霉素来增强自身对棒曲霉素的耐受力,这与Castoria等的报道相符[21]。此外,Ianiri等[22]推测,棒曲霉素的生物降解由多个步骤组成,包括起始时菌体被激发起对棒曲霉素的耐受力。

图6 S. cerevisiae对棒曲霉素的耐受力(NYDB培养基中)Fig.6 Tolerance of S. cerevisiaeto patulin in NYDB medium

2.3 S. cerevisiae KD和L. lactis MG1363 在苹果汁中对棒曲霉素的降解及发酵作用

在前期的实验基础上,设置4个处理组,利用S.cerevisiaeKD和L.lactisMG1363对苹果汁进行混合发酵,2 d后对所有处理组中的棒曲霉素含量进行检测,发现棒曲霉素均已被完全降解。

进一步对发酵液中的总可溶性固形物、酸度、黄酮含量、总酚含量进行了检测。由表2可知,处理组三中可溶性固形物发生了显著下降(p<0.05),而其他处理组由于在发酵前添加了9%蔗糖,因而其可溶性固形物与纯苹果汁相比差异不大,甚至略有升高。同对照组相比,发酵后处理组一、二、三、四的酸度分别增加了1.3%、1.3%、1.2%、0.9%。酚类对果蔬的成熟衰老、抗病性、抗逆性均有重要影响,并有清除自由基、改善心血管疾病、抗发炎等活性[23]。4个处理组中总酚含量分别比对照上升了24%、37%、29%、42%。然而,发酵前后苹果汁中黄酮的含量没有发生显著变化。目前,已知的微生物降解棒曲霉素的产物主要有ascladiol和desoxypatulinic acid[24],而S. cerevisiae降解棒曲霉素的产物为ascladiol[17]。据报道,棒曲霉素有较强的细胞毒性,而其降解产物ascladiol对人体的肝脏细胞、膀胱细胞、小肠细胞等均无细胞毒性[25]。本文利用S.cerevisiaeKD和L.lactis对苹果汁进行发酵,不仅控制了棒曲霉素的污染,去除了毒素的毒性,而且提高了苹果汁中的总酚含量,增加附加值。通过添加一定的风味物质并进行感官评定,可进一步改善发酵果汁的口感,为菌株在被棒曲霉素污染的苹果汁上的商业化应用打下基础。

表2 发酵苹果汁的品质评估Table 2 Quality assessment of fermented apple juice

3 结论

棒曲霉素是自然界中主要的真菌毒素之一,尤其在水果、谷物及其制品中较为常见。本研究表明,S.cerevisiaeKD在NYDB培养基和市售100%苹果汁中，均能高效控制棒曲霉素的污染,且酵母的起始浓度、棒曲霉素的起始浓度、环境pH等因素对酵母去除棒曲霉素的效率有一定程度的影响。S.cerevisiaeKD对棒曲霉素的耐受力较强,在棒曲霉素浓度高达100 mg/L的环境下依然能较好生长。利用S.cerevisiaeKD和L.lactisMG1363对苹果汁进行联合发酵,不仅能完全去除苹果汁中棒曲霉素的污染,还能增强果汁的营养价值。因此,本文的研究结果为控制苹果汁中棒曲霉素的污染、保证食品安全,提供新的途径。