王敏 耿清伟 高亚丽 华优 宋秀祖

310009杭州，安徽医科大学杭州临床学院 杭州市第三人民医院皮肤科

自噬是真核细胞一种重要代谢过程，通过溶酶体降解细胞内变性的蛋白质、细胞器等物质以维持正常生理功能。既往研究证实[1⁃4]，白癜风患者黑素细胞存在自噬异常，通过促进自噬恢复黑素细胞正常生理功能可能对白癜风的治疗具有重要意义。窄谱中波紫外线（NB⁃UVB）治疗白癜风效果显著，既往研究已经证实，NB⁃UVB可以促进黑素细胞增殖、黑素合成及黑素细胞迁移，但具体机制尚未完全阐明[5]。本研究拟观察NB⁃UVB对黑素细胞自噬水平及自噬信号途径的影响，进一步明确NB⁃UVB治疗白癜风的机制。

资料与方法

1.细胞、试剂及仪器：经杭州市第三人民医院伦理委员会批准同意并获得患者知情同意，人黑素细胞取自本院泌尿外科包皮环切废弃皮肤，按文献[6]方法采用Hu16完全黑素细胞培养基培养。单丹（磺）酰戊二胺（MDC）为美国Sigma公司产品。鼠抗磷酸化磷酸腺苷蛋白激酶（p⁃AMPK）单克隆抗体、兔抗磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（p⁃mTOR）单克隆抗体、兔抗微管相关蛋白轻链3（LC3）多克隆抗体及鼠抗P62单克隆抗体（美国Abcam公司）；SS⁃01型NB⁃UVB辐照仪（上海希格玛高技术有限公司），NB⁃UVB辐照仪（美国Solarlight公司）经过Solar PMA辐射计校正。图像采集使用Olympus BX⁃51荧光显微镜（日本奥林巴斯公司）。

2.NB⁃UVB照射：体外培养的人黑素细胞接种至培养皿中，待细胞生长至80%融合时进行NB⁃UVB照射。照射前除去培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗1次后，加入薄层PBS，以刚好覆盖细胞为度。NB⁃UVB照射剂量设定0、50、100及200 mJ/cm2四组（照射时间分别为0、5、9及18 s）。照射后除去上覆的PBS，加入培养基继续培养24h。

3.MDC染色法标记自噬体：黑素细胞经NB⁃UVB照射后24h，加入5 mmol/L MDC，调整MDC终浓度为0.05 mmol/L。再放入37℃、5%CO2培养箱孵育30 min。除去培养液，PBS洗涤3次，加入4%多聚甲醛溶液室温固定40 min。荧光显微镜观察拍照，细胞内散在亮绿色荧光即为自噬体。每个细胞内自噬体超过3个为自噬体阳性细胞。每组选择8个视野，对各组细胞进行自噬体阳性细胞计数并统计阳性百分率。

4.免疫印迹检测自噬信号表达：黑素细胞经NB⁃UVB照射后24h，常规提取蛋白并定量。将定量后的蛋白进行凝胶电泳，硝酸纤维素膜转膜，5%脱脂牛奶液室温封闭1h。分别加入兔抗p⁃mTOR、LC3抗体及鼠抗p⁃AMPK、P62抗体，4℃孵育过夜，TBST液洗膜3次，每次10 min。加入辣根过氧化物酶（HPR）标记的羊抗鼠或羊抗兔IgG，室温孵育1h，TBST液洗膜3次。化学发光法检测目的条带，用Image J软件分析条带的灰度值，以目的片段与β肌动蛋白灰度比值作为蛋白表达水平进行统计学分析。

5.透射电镜观察超微结构：黑素细胞经NB⁃UVB照射后24h，消化离心收集细胞，2.5%戊二醛固定，1%锇酸后固定，乙醇梯度脱水，丙酮处理，包埋，切片及染色，透射电镜下观察。每组选择8个视野观察与拍照，计数黑素小体、自噬体及自噬溶酶体。

6.统计学分析：采用SPSS 20.0软件进行统计分析，各组间MDC染色、免疫印迹结果采用单因素方差分析比较，SNK法进行两两比较。黑素小体、自噬体与自噬溶酶体数量采用Kruskal⁃Wallish检验进行统计分析，并用Mann⁃Whitney检验进行两两比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.MDC法测定黑素细胞自噬体变化：荧光显微镜下黑素细胞核周可见亮绿色荧光聚集，4组间自噬体阳性细胞百分率（表1）差异有统计学意义（P＜0.01），100、200 mJ/cm2组均显著高于对照组和50 mJ/cm2组，与对照组相比，q值分别为6.75、10.68；与50 mJ/cm2组相比，q值分别为5.55、8.48；均P＜ 0.05。而50 mJ/cm2组与对照组、200 mJ/cm2与100 mJ/cm2组相比，差异均无统计学意义（q值分别为0.76、1.11，均P＞ 0.05）。见图1、表1。

图1 不同剂量NB⁃UVB照射黑素细胞后MDC染色变化 与对照组相比，50 mJ/cm2组自噬体阳性细胞（白色箭头）数量无明显增多；100和200 mJ/cm2组显著增多

表1 不同剂量NB⁃UVB照射黑素细胞后自噬体染色阳性率、黑素小体数量、自噬体与自噬溶酶体数量以及免疫印迹检测自噬相关蛋白表达变化（±s）

表1 不同剂量NB⁃UVB照射黑素细胞后自噬体染色阳性率、黑素小体数量、自噬体与自噬溶酶体数量以及免疫印迹检测自噬相关蛋白表达变化（±s）

注：n=8。以目的片段与β肌动蛋白灰度比值作为自噬相关蛋白表达水平。aF值；bH值

自噬相关蛋白组别对照组50 mJ/cm2组100 mJ/cm2组200 mJ/cm2组F/H值P值自噬体染色阳性率（%）21.83±3.50 23.66±4.12 38.08±4.10 40.23±1.45 37.88a＜0.05黑素小体（个/视野）18.50±4.18 39.12±9.42 57.38±7.11 59.75±15.15 23.58b＜0.05自噬体与自噬溶酶体（个/视野）1.88±1.18 2.88±1.36 5.12±1.13 5.25±1.04 20.73b＜0.05 p⁃AMPK 0.40±0.02 0.51±0.04 0.85±0.05 0.84±0.06 105.05a＜0.05 p⁃mTOR 0.82±0.03 0.81±0.04 0.64±0.04 0.63±0.01 37.03a＜0.05 LC3Ⅱ/Ⅰ1.06±0.04 1.11±0.04 1.49±0.09 1.47±0.08 41.81a＜0.05 P62 0.94±0.08 0.99±0.10 0.63±0.05 0.69±0.02 25.62a＜0.05

2.免疫印迹法检测p⁃AMPK、p⁃mTOR、LC3Ⅱ/Ⅰ及P62的表达：见表1。4组间p⁃AMPK、p⁃mTOR、LC3Ⅱ/Ⅰ及P62表达差异有统计学意义（均P＜0.05）。100、200 mJ/cm2组p⁃AMPK表达量显著增多，与对照组比，q值分别为 17.34、13.38；与 50 mJ/cm2组比，q值分别为11.20、9.03；均P＜ 0.05；LC3Ⅱ/Ⅰ表达亦显著增加，与对照组比，q值分别为8.40、8.51；与50 mJ/cm2组比，q值分别为7.33、7.35；均P＜ 0.05。p⁃mTOR及P62蛋白表达量显著下调，p⁃mTOR与对照组相比，q值分别为7.47、11.34；与50 mJ/cm2组相比，q值分别为5.80、7.43；P62与对照组相比，q值分别为 6.29、5.55；与 50 mJ/cm2组相比，q值分别为6.58、5.89，均P＜ 0.05。见图2、表1。

图2 免疫印迹法检测NB⁃UVB照射黑素细胞后p⁃AMPK、p⁃mTOR、LC3Ⅱ/Ⅰ及P62的表达 1 ～ 4：分别为0（对照组）、50、100、200 mJ/cm2组。100、200 mJ/cm2组p⁃AMPK、LC3Ⅱ/Ⅰ表达显著增加，而p⁃mTOR及P62蛋白表达量显著下降

3.透射电镜观察自噬体、自噬溶酶体及黑素小体变化：黑素细胞中见清晰的黑素小体，呈致密深黑色圆形或椭圆形颗粒状结构，着色程度不同，散在或聚集分布。同时可见双层膜状结构的自噬体、单层膜结构的自噬溶酶体。4组间自噬体与自噬溶酶体数量差异有统计学意义（H=20.731，P＜0.05）。见表1。100、200 mJ/cm2组自噬体与自噬溶酶体数量显著增多，与对照组比，Z值分别为3.26、3.30，与 50 mJ/cm2组比，Z值分别为 2.86、3.03，均P＜ 0.05；200mJ/cm2组与100mJ/cm2组相比、50mJ/cm2组与对照组相比，差异均无统计学意义（Z值分别为0.27、1.48，均P＞ 0.05）。

4组间黑素小体数量差异也有统计学意义（H=23.583，P＜ 0.05）。50、100、200 mJ/cm2组与对照组相比，黑素小体数量均显著增多（Z值分别为3.37、3.37、3.37，均P＜ 0.05）；100、200 mJ/cm2组分别与50 mJ/cm2组相比，差异有统计学意义（Z值分别为3.10、2.52，均P＜ 0.05）；100 mJ/cm2组与200 mJ/cm2组相比差异无统计学意义（Z=0.42，P＞ 0.05）。见图3、表1。

讨 论

白癜风发病机制尚未明确，遗传、环境、氧化应激、自身免疫等因素均可能与其发病相关[7⁃8]。近年来研究表明，自噬在白癜风的发病中亦发挥重要作用[3]。自噬缺陷的黑素细胞可导致氧化还原失衡，从而破坏黑素细胞，可能与白癜风的发病机制相关[9]。进一步研究证实，诱导白癜风患者皮损周围黑素细胞自噬，发现黑素细胞的小眼畸形相关转录因子、酪氨酸酶及酪氨酸酶相关蛋白1表达均显著升高，促进黑素合成[10]。因此推测自噬参与了白癜风的发生、发展过程。

既往研究[11⁃12]证实，NB⁃UVB照射能促进黑素细胞增殖及黑素合成，并且可以促进黑素细胞迁移，在白癜风复色中发挥作用。NB⁃UVB还可通过下调黑素细胞miRNA⁃25的表达，促进黑素细胞增殖，增加酪氨酸酶活性及黑素生成[11⁃12]。既往研究发现[13⁃14]，适宜剂量的UVB照射可以促进HaCaT细胞及人皮肤成纤维细胞自噬。我们的前期研究观察到，UVB具有促进表皮细胞自噬的作用[15]。本研究首先观察了NB⁃UVB对正常黑素细胞自噬的影响，结果显示，100、200 mJ/cm2NB⁃UVB照射正常黑素细胞，MDC染色强度显著增强，染色阳性细胞数量增多，表明NB⁃UVB可以促进正常黑素细胞发生自噬。

为进一步确证自噬的发生，我们采用透射电镜观察了正常黑素细胞的超微结构变化。结果显示，正常黑素细胞中黑素小体随着NB⁃UVB照射剂量的增大而增多，细胞质内可见较多单层膜空泡状的自噬溶酶体及较少的双层膜自噬体。而100、200 mJ/cm2NB⁃UVB照射组与对照组相比，自噬体及自噬溶酶体形成显著增多，证实NB⁃UVB照射对正常黑素细胞自噬具有促进作用。Zhang等[16]研究发现，缺乏自噬蛋白Atg7的黑素细胞出现早衰，细胞内累积了较多的氧化损伤产物、泛素化蛋白及衔接蛋白P62，并导致自噬缺陷小鼠出现表皮轻度色素减退。此外，有研究[17]发现，结节性硬化症患者的色素减退斑与黑素细胞自噬失调相关。结合我们的研究结果及以往研究报道，推测NB⁃UVB可通过上调黑素细胞的自噬水平促进黑素细胞存活，在白癜风治疗中发挥作用。

图3 透射电镜观察黑素细胞经不同剂量NB⁃UVB照射后黑素小体、自噬体与自噬溶酶体数量的变化 A：自噬体与自噬溶酶体；M：黑素小体。黑素小体数量的变化：对照组细胞核旁见少量黑素小体，部分聚集；50 mJ/cm2组可见胞质中较为稀疏的黑素小体，较对照组稍增多；100与200 mJ/cm2组均见胞质中密集分布的黑素小体。自噬体与自噬溶酶体：对照组可见自噬体和自噬溶酶体；50 mJ/cm2组较对照组稍增多；100与200 mJ/cm2组均较对照组与50 mJ/cm2组显著增多

AMPK/mTOR信号途径是自噬的重要信号通路[18]。LC3是自噬的标志蛋白，LC3Ⅰ转化为LC3Ⅱ的水平标示着自噬的活化程度[19]。P62是选择性自噬途径中的重要蛋白，其作为泛素化蛋白与自噬囊泡衔接蛋白，将泛素化蛋白转运至自噬体中降解，其蛋白表达与自噬强度成反比，自噬缺陷的细胞中常观察到P62蓄积[20⁃21]。我们的研究表明，NB⁃UVB照射培养的人正常黑素细胞，可以抑制其p⁃mTOR信号活化，促进p⁃AMPK活化从而诱导自噬发生。进一步研究观察到，LC3Ⅱ/Ⅰ显著升高，P62蛋白表达显著下降。Bridgeman等[22]研究表明，芹菜素可通过活化AMPK，抑制mTOR信号通路，调节UVB照射诱导的角质形成细胞自噬水平。

综上所述，NB⁃UVB照射正常黑素细胞，可以活化其自噬信号通路，促进自噬相关蛋白表达，诱导自噬体和自噬溶酶体增加。推测NB⁃UVB治疗白癜风的机制可能与其提高白癜风患者黑素细胞的自噬水平相关，进一步的动物或临床试验可加以证明。