P10B抗菌肽和硫酸小檗碱对肉鸡源大肠杆菌的体外联合抗菌作用研究

2018-10-10范学政马健陶庆树刁有江

中国兽药杂志 2018年9期

范学政，马健，陶庆树，刁有江*

(1.中国兽医药品监察所，北京 100081；2.山东农业工程学院，济南 25000)

鸡大肠杆菌病是由某些致病性大肠杆菌引起的鸡的传染病的总称[1]。鸡大肠杆菌感染是规模化饲养场的常见病，是引起肉鸡细菌性感染的主要致病因素。近年来，随着抗生素的大量使用，大肠杆菌对传统抗菌药的耐药现象和抗菌药物残留问题日渐严峻，促使人们寻找抗生素的替代品[2]。抗微生物天然产物以其来源广泛、不易产生耐药性和绿色安全等特点而备受关注。抗菌肽是一类具有抗菌活性的新型抗菌药，一般由几十个氨基酸残基组成，不仅具有广谱的抗菌作用，而且不易产生耐药性，是抗生素的理想替代品[3]。P10B抗菌肽是针对大肠杆菌筛选得到的一个肽类先导化合物，初步试验发现其对大肠杆菌具有良好的抗菌作用。小檗碱是黄连、黄柏中的主要抗菌活性成分，常用来治疗细菌性肠炎[4]。与临床常用的盐酸小檗碱相比，硫酸小檗碱的研究文献较少，小檗碱硫酸盐水溶性较高，更适合制成水溶性制剂，方便临床应用。本文拟通过对P10B抗菌短肽和硫酸小檗碱对大肠杆菌的体外联合抗菌作用进行研究，评价两种抗菌药的联合用药效果，以期为兽医临床新型复方抗菌制剂的开发提供科学依据。

1 材料

1.1 供试药品抗菌肽P10B，氨基酸序列为QKRPRVRLSA，分子量为1210.46，含量95%，样品编号CL-2482，由上海强耀生物科技有限公司合成；硫酸小檗碱，含量95%，批号20170306，由济南美事达兽药有限公司提供；硫酸庆大霉素，含量为630 IU/mg，批号130326-201015，购自中国食品药品检定研究院。

1.2 受试菌株大肠杆菌肉鸡源临床分离株20株，由山东农业工程学院兽医药理与毒理实验室提供。

1.3 质控菌株大肠杆菌标准菌株ATCC25922，购自中国食品药品检定研究院。

1.4 培养基和试剂 MH肉汤培养基、LB肉汤培养基、麦康凯培养基购自杭州天和微生物试剂有限公司；磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钙、氯化钠等试剂购自天津科密欧化学试剂有限公司。各种培养基按文献[5]进行配制，其中MH肉汤按正常使用浓度的单倍和双倍两种规格配制成阳离子调节的MH肉汤培养基[6]。

2 方法

2.1 药物储备液的配制及保存根据预试验，称取适量硫酸小檗碱，加入灭菌蒸馏水，制成浓度为4096 μg/mL 的硫酸小檗碱溶液；称取适量P10B抗菌肽，加入灭菌蒸馏水，制成浓度为5120 μg/mL的P10B抗菌肽溶液；两种溶液分别用0.22 μm滤膜过滤除菌，制成抗菌储备液。抗菌储备液无菌分装后，置于-20 ℃冰箱保存，备用。庆大霉素，用灭菌蒸馏水溶解，得到浓度为1280 IU/mL的庆大霉素抗菌储备液。

2.2 菌悬液的制备取纯化的大肠杆菌单个菌落，接种到LB液体培养基，过夜培养后，转接到单倍MH肉汤培养基中，37 ℃，200 r/min振荡培养至对数生长期。取待测菌0.5 mL，装入测试管，在600 nm波长下测定菌液OD值。以单倍MH肉汤为对照，用单倍MH肉汤调整OD值为0.08～0.1，得到浓度约为108CFU/mL的菌悬液[7]，再用单倍MH肉汤将待测菌浓度调整为1×106CFU/mL，备用。

2.3 单个抗菌药对大肠杆菌的最小抑制浓度(MIC)的确定参考CLSI抗菌药物敏感试验执行标准[6]，采用微量肉汤稀释法对大肠杆菌分离株进行药物敏感性检测，并以大肠杆菌ATCC25922为质控菌株，CLSI质控参数中没有给出硫酸小檗碱的判定标准，在此以庆大霉素作为质控用药。每个测试单元体系为200 μL，其中包括抗菌药测试液50 μL、双倍MH肉汤50 μL、菌悬液100 μL。硫酸小檗碱、P10B、庆大霉素的最高测试液浓度分别为1024 μg/mL、128 μg/mL和32 IU/mL。根据预试验，各药测试液浓度，以两倍的级差递减，得到10个浓度梯度。

取灭菌96孔U型板，无菌条件下，每排第一孔分别加入抗菌药工作液100 μL，硫酸小檗碱、P10B、庆大霉素的工作液浓度分别为4096 μg/mL、512 μg/mL和128 IU/mL。然后，在每排第二孔至第十孔，分别加入灭菌蒸馏水50 μL。从第一孔吸取药液50 μL，加至第二孔，吹打混匀后，从第二孔吸取混和液50 μL，加至第三孔，依次倍比稀释至第十孔，从第十孔中吸取50 μL弃去。从第一孔到第十孔，分别加入2倍MH肉汤培养基50 μL，在第十一孔加入单倍MH肉汤培养基200 μL。从第一孔到第十孔，分别加入已经调整浓度的菌悬液100 μL，在第十二孔加菌悬液和单倍MH肉汤各100 μL。密封96孔板，震荡混匀后，置37 ℃生化培养箱内培养20 h后观察并记录结果。每个试验重复三次，同时设立质控菌ATCC25922对照。

2.4 联合药敏试验根据单药MIC试验结果，按2倍逐级递减，以MH肉汤为稀释液，分别制备4×MIC～1/16 ×MIC 7种工作浓度的硫酸小檗碱和P10B抗菌液，将两药各浓度组成7×7方阵，联合用药。取灭菌96孔板，沿纵列，浓度由低至高，分别从第七列至第一列加入硫酸小檗碱抗菌液，每孔各加50 μL；沿横排，浓度由低到高，分别从第七排至第一排加入P10B抗菌液，每孔各加50 μL[8]。7×7方阵中每孔各加菌液100 μL。纵向第八列，从上至下，7孔只加单倍肉汤200 μL作为空白对照；横向第八排，从左向右，7孔各加菌液和单倍肉汤100 μL，作为菌液生长对照。将96孔板密封，震荡混匀后，置37 ℃生化培养箱内培养20 h后观察并记录结果。每个试验重复三次，同时设立质控菌ATCC25922对照。

2.5 结果判定

2.5.1 MIC结果判定当质控菌大肠杆菌ATCC25922的测试参数最低抑菌浓度在质控范围内时，肉眼观察能完全抑制孔内大肠杆菌生长的最小的抗菌药物浓度，即为该药的MIC[7]。当出现跳孔时，按参考文献[8]进行处理。

2.5.2 分级抑菌浓度(FIC)指数的结果判定[9]FIC指数=MIC小檗碱联合/MIC小檗碱单用+MICP10B联合/MICP10B单用，当FIC指数≤0.5判为协同作用；当该指数为0.5～1，判为相加作用；当该指数为1～2 判为无关作用；当该指数>2，判为拮抗作用。

3 结果与分析

3.1 单个抗菌药对大肠杆菌的药敏试验结果如表1所示，硫酸小檗碱对不同大肠杆菌临床分离株的MIC范围为128～1024 μg/mL，以MIC 512 μg/mL居多，MIC平均值为531.2 μg/mL。P10B对不同大肠杆菌临床分离株的MIC范围为8～32 μg/mL，以MIC 16 μg/mL居多，MIC平均值为17.2 μg/mL。质控菌ATCC25922的测定结果在质控范围内，说明药物敏感性检测结果可靠。

3.2 联合用药药敏试验结果硫酸小檗碱与抗菌肽P10B对大肠杆菌的联合药敏试验结果见表1。在联合药敏试验中，两药联用呈协同作用的占10%，呈相加作用的占85%，呈无关作用的占5%。平均分级抑菌浓度指数为0.825，说明两种药联用时，药物效应主要表现为累加作用。质控菌ATCC25922的测定结果在质控范围内，说明药物敏感性检测结果可靠。

4 讨论

本研究以临床分离的肉鸡源大肠杆菌为抑制对象，检测了植物源抗菌药物硫酸小檗碱与抗菌肽先导化合物P10B单用时的MIC及联合使用时的FIC指数。

硫酸小檗碱对大肠杆菌临床分离株的MIC以512 μg/mL为主，说明硫酸小檗碱对大肠杆菌的抗菌作用为抑菌作用。这与袁敏等对盐酸小檗碱的检测结果相吻合[10]。小檗碱是来源于植物的异喹啉类生物碱。在自然界中，天然产物往往对革兰氏阳性菌的抗菌作用明显。魏常志等研究发现小檗碱对金黄色葡萄球菌的抗菌强度最高[11]。硫酸小檗碱对大肠杆菌临床分离株的MIC值较高，这可能与大肠杆菌等革兰氏阴性菌的外部结构有关，小檗碱的脂溶性较差，从而导致小檗碱不易进入大肠杆菌细胞内[12]。小檗碱口服吸收差，对大肠杆菌肠毒素引起的分泌性腹泻具有良好的治疗作用[13]。在兽医临床上，硫酸小檗碱更适合开发为治疗肠道感染的药物。

抗菌肽先导化合物P10B对大肠杆菌临床分离株的MIC以16 μg/mL为主，初步显示了对禽源致病性大肠杆菌良好的抗菌作用。提示P10B具有开发为新型抗大肠杆菌感染药物的潜力。抗菌肽是生物体内广泛存在的抗菌活性物质，不易产生耐药性，在细菌耐药和多重耐药问题日益严峻的今天，抗菌肽已成为兽医临床上抵抗细菌性感染的重要的潜在候选药物[14]。在硫酸小檗碱与P10B对大肠杆菌的联合药敏试验中，平均分级抑菌浓度指数为0.825，说明两种药在体外联用时药效增强，主要表现为累加作用。两药联用时的MIC均有不同程度的下降，无拮抗现象，提高了抗菌效能。有益的联合用药可以增强药物效应，提高临床疗效，降低副作用，延缓耐药性的产生[15]。本试验的检测结果提示，在临床上解决禽大肠杆菌肠道感染时，硫酸小檗碱与P10B组合可能是一种有效的联合用药方式。

表1 硫酸小檗碱与P10B单用和联用时对大肠杆菌的体外抗菌作用结果Tab 1 The antibacterial effects in vitro of berberine sulfate combined with antibacterial peptide P10B against E.coli

*MIC单位：μg/mL