苏柳钦,张健强,何盛斌,吴丽娜,颜晓梅

(厦门大学 化学化工学院,谱学分析与仪器教育部重点实验室,化学生物学福建省重点实验室,福建厦门361005)

蛋白-蛋白相互作用是细胞生化反应网络的重要组成部分,参与了各种代谢途径和生理过程[1-2]．对蛋白-蛋白相互作用进行分析有助于解析疾病的发生机制,对药物的设计筛选具有重要的指导意义[3]．基于腺苷酸环化酶(adenylate cyclase,AC)功能重构的细菌双杂交(bacterial adenylate cyclase two-hybrid,BACTH)系统是蛋白-蛋白相互作用经典技术酵母双杂交系统的衍生,具有实验周期短、转化率高、蛋白无需核定位等优点[4]．BACTH系统利用了百日咳博代杆菌(Bordetellapertussis)中的AC催化域是由两个互补片段T25和T18组成的特点,当T25和T18分别与可发生相互作用的多肽或者蛋白质融合表达时,嵌合蛋白的二聚化可以导致AC片段功能性的互补以及环腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)的生成，cAMP与分解代谢激活蛋白(catabolite activator protein,CAP)结合,从而调控报告基因的表达[5]．目前,BACTH系统已被广泛应用于特定蛋白对的相互作用鉴定以及蛋白质相互作用文库的筛选[6-7]．在生命医学研究方面,BACTH系统也发挥了重要的作用．Zoued等[8]通过对细菌Ⅵ型分泌系统的收缩鞘中各组件的相互作用分析,揭示了其聚合的操纵机制以及内管装配的协调机制．Tao等[9]利用BACTH系统对肉毒毒素B进行饱和诱变筛选,增强了工程型肉毒毒素B特异性地靶向人类突触结合蛋白Ⅱ,提高了肉毒毒素B对神经性疾病的治疗效果．

BACTH系统主要以lacZ为报告基因,对于报告基因所表达的β-半乳糖苷酶,传统的检测方法主要是通过测定邻-硝基酚-β-D-半乳糖苷或4-甲基伞形酮酰-β-D-吡喃半乳糖苷这类特异性底物水解产生的分子吸光度或荧光的变化对酶活性进行检测[4,10]．然而，这类方法得到的是大量细菌中β-半乳糖苷酶表达量及活性的平均结果,掩盖了细菌个体间β-半乳糖苷酶表达量的差异．在单细菌水平考察β-半乳糖苷酶的表达有利于更好地解析基因表达的随机性、基因调控以及微生物的生理过程,对深入理解BACTH系统的工作机理从而针对性地改进实验方法也有极大帮助．此外,单细菌水平的蛋白-蛋白相互作用研究有助于更准确地考察蛋白在细菌介导的活细胞中相互作用的状况,对于揭示蛋白-蛋白相互作用相关信号转导的分子机制具有明显优势[11]．流式细胞术是一种功能强大的单细胞分析手段,具有检测速度快、精度高和多参数分析等特点,已在蛋白质组学和系统生物学中发挥重要的作用[12]．然而,由于细菌个体微小,传统的流式细胞仪难以在单细菌水平对其内部的蛋白质进行定量分析并考察蛋白-蛋白相互作用．结合瑞利散射和鞘流单分子荧光检测技术,本课题组自行研制的超高灵敏流式检测装置(HSFCM)散射光通道可实现粒径为24 nm的二氧化硅纳米颗粒和粒径为7 nm的金纳米颗粒的检测,荧光通道的检测灵敏度为3个Alexa Fluor 532分子[13],较传统流式细胞仪的散射和荧光检测灵敏度分别提升4～5个数量级和1～2个数量级,已被开发应用于细菌生化体系的分析[14-18]．

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌种与质粒

菌株:大肠杆菌(Escherichiacoli) ER2738，在质粒构建中使用；大肠杆菌BTH101(基因型:F-,cya-99,araD139,galE15,galK16,rpsL1,hsdR2,mcrA1,mcrB1),由法国地中海微生物研究中心Emmanuelle Bouveret博士惠赠,为BACTH系统的报告菌株．

质粒：pEB354(pKT25-linker)、pEB355(pUT18C-linker)、pEB356(pUT18C-pal)由Emmanuelle Bouveret博士惠赠；pTW2(含lac启动子调控的gfp基因)由中国科学院微生物研究所杨克迁博士惠赠；质粒pKT25-His-tolB、pKT25-lac-T18、pKT25-His-tolB-lac-T18-pal为本课题组构建．

1.1.2 试 剂

限制性内切酶XhoⅠ、TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0购自宝生物工程(大连)有限公司，TransStart FastPfu DNA Polyme-rase(AP221-01)、5×TransStart FastPfu Buffer、dNTP mixture购自北京全式金公司，Seamless Assembly and Cloning Kit购自北京艾德莱生物科技有限公司，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖(X-gal)、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)购自上海生工生物工程有限公司，本研究所涉及的引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列如表1所示．

表1 本研究所用引物

1.1.3 主要仪器

超净工作台(Airtech公司)，DYCP-31F琼脂糖水平电泳仪(北京六一仪器厂)，SKY 200B小型全温恒温培养摇床(上海苏坤实业有限公司)，DHP-9162电热恒温培养箱(上海一恒科技有限公司)，Allegra X-15R Centrifuge低温冷冻离心机(Beckman公司)，T100TMThermal Cycler基因扩增仪(BIO-RAD 公司)，IX73 型倒置荧光显微镜(Olympus 公司)，本课题组自行研制的HSFCM．

1.2 方 法

1.2.1 质粒的构建

最早知道爱克发还是在儿时，记忆中Agfa胶卷是摄影发烧友的最爱，而这段回忆也拉近了我们与这位影像巨头的距离。从初创岁月到今天的数码时代，爱克发对影像的关注从未停步，150多年的深耕细作不仅构成了其现有的三大产业版图：由印版、CTP、喷墨设备、软件等产品组成的印艺板块，以及医疗板块、特殊材料板块，其中，印艺板块占据其产业版图的半壁江山，更使其以细分领域领导者的身份与实力，引导影像领域的技术变革和产业创新。

质粒pKT25-lac-T18的构建:以质粒pEB355为模板,用表1中引物lac-T18-F/lac-T18-R扩增基因片段lac-T18,同时,用限制性内切酶XhoⅠ对质粒pEB354进行单酶切,扩增出的基因片段和酶切产物经过琼脂糖凝胶电泳分析后,用TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0试剂盒进行纯化,最后两个片段采用Gibson组装连接[21]．

(a)流体动力学聚焦样品流与激光光斑正交于流动室的示意图;(b)光路图．图1 实验室自行研制的双通道HSFCM示意图Fig.1 Schematic diagram of the laboratory-built dual-channel high sensitivity flow cytometer (HSFCM)

质粒pKT25-His-tolB-lac-T18-pal的构建:以质粒pEB356为模板,用表1中引物lac-T18-pal-F/lac-T18-pal-R扩增基因片段lac-T18-pal,同时,用限制性内切酶XhoⅠ对质粒pKT25-His-tolB进行单酶切,扩增出的基因片段和酶切产物经过琼脂糖凝胶电泳分析后,用TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purifi-cation Kit Ver.4.0试剂盒进行纯化,最后两个片段采用Gibson组装连接[21]．

1.2.2 细菌样品的制备

提取质粒pKT25-lac-T18、pKT25-His-tolB-lac-T18-pal,以BTH101作为报告菌株,按pKT25-lac-T18/pTW2、pKT25-His-tolB-lac-T18-pal/pTW2的组合进行共转化．共转化时两种质粒依次加入,细菌复苏后涂布于含氨苄青霉素和卡那霉素的LB/IPTG/X-gal固体培养基上,于30 ℃培养48 h．随后从平板上随机挑取单菌落,接种于LB培养基中,培养22 h．移取50 μL菌液离心,用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤一次后弃上清,于4 ℃下保存,待测．

1.2.3 单细菌水平gfp报告基因的表达分析

HSFCM检测:将待测样品用PBS调节细菌浓度至109mL-1后上机检测,同时收集散射光信号和绿色荧光信号(BP520/35)．所用的HSFCM分为4个部分,分别为激光光源和光束形成系统、流动室和液流驱动系统、光路系统(包括各种滤光片)以及信号检测、存储、显示和分析系统[22-24]．如图1所示,它的工作原理为:分散在溶液中的细菌与溶液一起由氮气驱动进入毛细管,从毛细管流出后,溶液在鞘液作用下被聚焦形成直径很小的液流,保证样品以单个细菌通过激光探测区；激光器发出的488 nm激光经反射镜(M)反射后,被消色差胶合透镜(L)聚焦为直径约10 μm的激光光斑,激光光斑与被鞘液流聚焦后的样品流正交于石英流动室(C)的中心处；样品由激光照射后发出的光信号经非球面透镜(AL)收集,被二向色滤光片(DicF-500)分成两束,波长小于500 nm的光信号(散射光)被90°反射入第1个光电倍增管(PMT-1)中检测,大于500 nm的光信号经过边缘滤光片(EF488)后,经过带通滤光片(BP520/35)滤除杂散光进入第2个光电倍增管(PMT-2)检测．

荧光显微镜成像:将待测样品用PBS调节细菌浓度至1010mL-1,吸取10 μL样品于载玻片上,洗耳球吹干后,滴加适量抗荧光猝灭剂,小心盖上盖玻片,并用指甲油将盖玻片固定；然后,在100×放大的油镜上滴加少量Nikon专用镜油,放上制备好的玻片观察．

2 结果与讨论

2.1 蛋白质相互作用的HSFCM检测原理

图2 基于GFP报告因子研究蛋白-蛋白相互作用的HSFCM检测原理Fig.2 Schematic of HSFCM detection based on GFP reporter protein for protein-protein interaction study

如图2所示,在BACTH-GFP系统中,质粒pKT25-X-lac-T18-Y能同时独立表达融合蛋白T25-X和T18-Y．质粒pTW2中含有一段从BTH101基因组中截取的lac启动子序列,用以启动下游gfp基因的表达[25]．将以上两种质粒共转化到报告菌株BTH101中,X和Y蛋白表达并相互作用会诱发T25和T18功能性互补，继而催化ATP生成cAMP,cAMP与CAP结合,激活gfp报告基因的表达,所发出的绿色荧光可以通过HSFCM检测．HSFCM每分钟可以对高至1万个颗粒的信号进行检测,应用HSFCM对单个细菌的散射光和荧光信号的同时检测可以实现蛋白质相互作用的单细菌水平的快速高通量分析．

2.2 单细菌水平蛋白质相互作用检测方法的建立

Tol-Pal系统是革兰氏阴性菌高度保守的膜蛋白系统之一,主要由转运蛋白TolB、TolA、TolR、TolQ和脂蛋白Pal之间相互作用组成．其中TolB蛋白和Pal蛋白组成了细菌外膜复合体,它们之间的相互作用对于维持革兰氏阴性菌细胞膜的完整性和稳定性至关重要[26]．本研究以Pal和TolB为模型,将它们克隆到双杂交质粒载体上,使它们分别与T18和T25片段融合表达,并以不含相互作用蛋白的质粒pKT25-lac-T18为阴性对照．如图3所示,细菌BTH101 pKT25-lac-T18/pTW2经过22 h培养后在绿色荧光检测通道只有微弱的背景荧光信号(图3(b)),表明不含相互作用蛋白的细菌无法激活gfp报告基因表达．而BTH101 pKT25-His-tolB-lac-T18-pal/pTW2在绿色荧光通道有强的荧光信号(图3(d)),但是其荧光信号与散射光信号并非一一对应,部分细菌只有散射光信号．根据两者的散射光信号与荧光信号峰面积的二维散点图(图3(e))以及荧光信号峰面积统计分布直方图(图3(f)),可以发现实验组样品在荧光通道分成了两群:66.1%的细菌的荧光信号强度明显高于阴性对照组,可见蛋白相互作用激活了gfp报告基因表达;另外33.9%的细菌的荧光信号分布与阴性对照组样品重叠,表明这部分细菌的gfp报告基因未被激活．造成这一现象的可能原因是:在BACTH系统中相互作用蛋白和报告基因的表达都受乳糖操纵子的调控,蛋白发生相互作用后生成cAMP,cAMP激活报告基因表达,生成的cAMP同样也能激活相互作用蛋白的表达[4]．因此,相互作用蛋白的表达、cAMP的生成、报告基因的表达形成了复杂的正反馈调节系统，造成了BACTH系统报告基因的异质性表达,部分细菌被完全激活而高表达蛋白,另外部分细菌未被激活而只有本底表达[19]．这种蛋白表达的差异容易被集权平均的检测方法所掩盖,因此,需要从单细菌水平分析才能揭示BACTH系统中蛋白表达存在的这种双稳态现象,更准确地分析蛋白质之间的相互作用．

采用荧光显微镜进一步对gfp报告的蛋白相互作用进行表征．如图3(g)～(j)所示,在荧光场视野下只有BTH101 pKT25-His-tolB-lac-T18-pal/pTW2可以观察到菌体发出明亮的荧光，对比明场下的细菌,可发现仍有部分细菌没有荧光,显微镜观察到的现象与HSFCM的检测结果一致．

2.3 培养时间对gfp报告基因表达的影响

为考察不同培养时间下BACTH-GFP系统报告因子表达量的变化，随机挑取共转化后在相应抗性筛选平板上形成的单菌落，于LB培养基中培养16 h后,每隔2 h取样分析．如图4所示,随着培养时间的增加,表达GFP报告因子的细菌比例逐渐增加(从16 h的20.3%升高至24 h的58.4%),这部分细菌的荧光信号中位值也随之增加(从16 h的17 224.5增加到24 h的29 740.6),说明单个细菌GFP报告因子表达量随培养时间的增加不断提高．当培养时间达到22 h之后,表达GFP报告因子的细菌比例以及单个细菌GFP报告因子表达量逐渐趋于稳定,因此选择培养22 h的细菌进行HSFCM 检测．

2.4 IPTG对gfp报告基因表达的影响

在BACTH系统中报告基因的表达受乳糖操纵子的调控,而乳糖操纵子存在正负调控机制．cAMP-CAP是一个重要的正调控物质,它与操纵子上的启动区结合,激活下游基因转录．另外,乳糖操纵子也受lacI基因编码的阻遏蛋白的负调控,阻遏蛋白通过与操纵子结合,阻止RNA聚合酶起始转录下游基因．当向体系中加入诱导剂时,诱导剂会优先与阻遏蛋白结合,使其结构发生变化,不再与操纵子上的DNA序列相结合,从而使RNA聚合酶能够起始转录下游基因[27]．IPTG是一种作用极强的乳糖操纵子诱导剂,不被细菌代谢且性质稳定,被广泛应用于诱导β-半乳糖苷酶的表达．因此,考察了不同浓度IPTG诱导下的gfp报告基因的表达情况．分别用0,50,200,500 μmol/L的IPTG对BTH101 pKT25-His-tolB-lac-T18-pal/pTW2进行诱导培养,测定培养16,18,20,22,24 h后细菌表达GFP报告因子的情况．如图5所示,随着培养时间的增加,表达GFP报告因子的阳性菌的荧光信号强度不断增加,然而在同一培养时间下,不同浓度IPTG对gfp报告基因的表达几乎没有影响．这可能是由于BTH101基因组中lacI基因表达的阻遏蛋白量较少,引入的多拷贝质粒中的lac启动子削弱了阻遏蛋白的负调控作用,导致IPTG无法发挥诱导作用[28]．

图5 在不同培养时间及不同浓度IPTG作用下表达GFP报告因子阳性菌的荧光信号强度中位值Fig.5 The median fluorescence intensities of positive cells with expression of GFP reporter protein induced with various concentrations of IPTG for different cultivation time

2.5 不同单菌落gfp报告基因表达的异质性分析

随机挑取了10个共转化后在相应抗性筛选平板上形成的单菌落,扩大培养22 h后采用HSFCM对细菌gfp报告基因表达情况进行分析．如图6所示,不同单菌落培养得到的菌液中表达GFP报告因子的阳性菌之间表现出较大的荧光信号强度差异(图6(a)),且表达GFP报告因子的细菌比例也呈现明显的差异(图6(b)),它们的平均值分别为16 022.9±3 742.8和(37.5±21.9)%,各自的变异系数为23.4%和58.1%．

这种异质性现象是由于细菌内质粒拷贝数不同导致蛋白表达量存在较大的差异,这些差异随着细菌的增殖被逐渐放大,最终导致单菌落之间蛋白表达的异质性[4]．此外,在BACTH系统中,双稳态现象也会造成单菌落之间蛋白表达的巨大差异．传统表征方法获得的是众多细菌蛋白表达集权平均的结果,掩盖了个体蛋白表达的异质性,基于GFP报告因子结合超高灵敏流式检测技术建立的研究方法从单细菌水平分析,真实地反映了报告基因的表达水平以及表达GFP报告因子的细菌所占比例,为蛋白质相互作用研究提供了更加直观准确的分析方法．

3 结 论

本研究中引入lac启动子控制的gfp作为蛋白质相互作用的报告基因,采用实验室自行研制的HSFCM建立了一种单细菌水平、高通量、快速的蛋白-蛋白相互作用分析方法．实验结果表明:蛋白-蛋白相互作用激活了gfp报告基因的表达,并存在双稳态现象．单细菌水平的HSFCM分析真实地反映了蛋白质相互作用报告基因的表达水平以及表达GFP报告因子的细菌所占的比例,相对于传统集权平均的表征方法更准确、简单．基于该方法,本研究发现不同单菌落GFP报告因子表达量和表达蛋白的细菌比例都存在较大的异质性．以上结果表明建立的单细菌水平BACTH-GFP分析方法能够揭示蛋白质相互作用报告基因表达的个体差异,有效地区分表达GFP报告因子的阳性菌和报告基因未被激活表达的阴性菌,为相互作用蛋白对的检测及筛选提供了有效的分析手段,将有助于对蛋白质结构和功能的解析．

(a) 表达GFP报告因子的阳性菌荧光信号强度中位值;(b) 表达GFP报告因子的细菌比例．图6 不同单菌落gfp报告基因表达的异质性分析Fig.6 Heterogeneity analysis of the expression of gfp reporter gene among different colonies