汪超甲 王辉

[摘要] 脑胶质瘤是颅内最常见的原发性恶性肿瘤，目前的手术、化疗、放疗效果欠佳，基因治疗可能成为未来脑胶质瘤的重要发展方向。现有的基因编辑技术有RNA干扰、TALEN、ZENs等，由于其设计操作复杂且脱靶率高，一直没能得到很好的应用。（CRISPR）/CRISPR-associated（Cas）9是很多细菌和大部分古生菌的天然免疫系统。通过对入侵的病毒和核酸进行特异性的识别，利用Cas蛋白进行切割，从而达到对自身的免疫，较上述的几种方法，具有明显的优势。本文就CRISPR/Cas9的结构功能及在脑胶质瘤治疗中的应用作一综述，以期为脑胶质的治疗提供新途径。

[关键词] CRISPR/Cas9；结构功能；脑胶质瘤；应用进展

[中图分类号] R739.41 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）06（c）-0024-04

[Abstrict] Glioma is the most common primary malignant tumor of the brain. Currently， surgery， chemotherapy and radiotherapy are not effective. Gene therapy may become an important development direction of glioma in the future. The existing gene editing techniques have RNA interference， TALEN， ZENs and so on. Because of their complex design operation and high miss distance， they have not been used well. （CRISPR） /CRISPR-associated （Cas） 9 is a natural immune system for many bacteria and most of the palaeophytes. By specific identification of the invaded virus and nucleic acid， the Cas protein is used to cut the virus to achieve its own immunity. Compared with the above methods， it has obvious advantages. This article reviews the structure and function of CRISPR/Cas9 and its application in the treatment of glioma， in order to provide a new therapeutic approach for the treatment of brain glia.

[Key words] CRISPR/Cas9； Structural function； Glioma； Application progress

腦胶质瘤是颅内发病率及恶性程度最高的原发性肿瘤。由于其发病机制不详，不能得到彻底治愈。研究发现其发生、发展和多因素、多基因的共同作用密切相关[1]。为了能够彻底治愈，就必须明确这些基因、因素的作用机制以及它们之间的相互作用，基因编辑技术的快速发展使得其成为可能。RNA干扰技术可以将目的基因沉默，使其功能减低，来研究基因在疾病中的作用。TALEN和ZFNs技术则通过对目标基因的相应片段进行敲除，使基因功能彻底丧失，进一步明确该基因的作用。CRISPR/Cas是新近发展起来的第3代基因编辑工具，可以对单基因或者多基因同时进行定点的插入、敲除、替换，更为简单、高效，并很快成为研究热点被广泛应用于肿瘤及遗传性疾病的研究中。本文从CRISPR/Cas的发现历史、结构功能、作用机制及应用，及其在脑胶质中的应用进展等方面进行综述，旨在为进一步的研究提供理论依据，也为从基因角度治愈脑胶质瘤带来曙光。

1 CRISPR/Cas的发现

CRISPR/Cas全称多成簇的、规律间隔的短回文重复序列相关蛋白，是细菌的一种获得性免疫系统。早在1987年，日本科学家在对细菌编码的碱性磷酸酶研究时就发现了串联间隔重复序列，但其功能一直未解[2]。直到2002年，这种序列才广泛在细菌和古生菌中发现，由此命名为CRISPR系统[3]。CRISPR/Cas9最早在乳酸菌中发现。2005年，有3个研究组同时发现串联间隔重复序列和外源pageDNA片段及侵染细菌的病毒具有高度同源特性。从而判断，这可能是类似siRNA免疫防御一样，是细菌抵抗外源page片段的一种机制。2013年这一系统在《Cell》被报道后[4]，至此，CRISPR/Cas系统逐渐被认识并应用于各种研究领域。

2 CRISPR/cas9系统的结构

CRISPR/Cas系统总共分为三类，CRISPR/cas9是其中第二类，应用最为广泛[5]。除共有的基因Cas1和Cas2外，只需要一种CRISPR相关蛋白即Cas9蛋白；而一类和三类的标记基因分别为Cas3和Cas10，除此之外还需要多种相关Cas蛋白，所以相对来说CRISPR/cas9结构更加简单，应用更加普遍[6]。CRISPR-Cas通常由识别和切割功能的两个重要部分组成。CRISPR位点由短的高度保守的重复序列组成，重复序列的长度一般为21～48 bp，之间被26～72 bp间隔序列隔开。不同细菌具有不同的重复序列及间隔序列，呈多样性。CRISPR就是通过这些间隔序列与靶基因进行识别。而切割部分cas蛋白存在于CRISPR位点附近，是一种双链DNA核酸酶，含有两个核酸酶结构域，能够分开切割双链DNA的两条核苷酸单链，即由gRNA引导并对靶位点进行切割。各类CRISPR-cas的剪切位点通常位于crRNA互补序列下游邻近的PAM区。不同类型的CRISPR-cas系统有着各自的PAM序列。就二型来说Cas蛋白由cas9单独构成，其PAM区以5′-GG-N18-NGG-3′为典型特征。在人类基因组中，平均每隔128 bp就出现1个NGG PAM，为靶点选择提供了方便[7]。

3 CRISPR/Cas9系统作用机制

CRISPR/Cas9作用机制可分为3个阶段：适应阶段、表达阶段和干扰阶段[8]。

适应阶段：当宿主菌受外源物质入侵后，外源质粒或噬菌体上的一小段DNA序列会以非同源重组的方式被整合到宿主菌的基因组中，整合的位置位于前导序列与第一个重复序列之间[9]，且每插入一段外源序列都会伴随着一次重复序列的复制，从而形成新的R-S结构。这一过程使得宿主CRISPR含有外源序列信息，为干扰阶段发挥作用提供基础。宿主对外源DNA序列的选择也并非随机的，有研究发现在前间区序列附近含有一些特定序列称为前间区序列邻近序列（protospacer adjacent motifs，PAMs）[10]，不同CRISPR亚型对于PAM的识别具有特异性。

表达阶段：CRISPR基因座首先被转录成一段长链的RNA，称为CRISPR RNA前体（Pre-crRNA），同时Cas蛋白将形成一个具有内切酶功能的复合物，特异性地将crRNA切割加工成小的成熟crRNA。成熟的crRNA会与Cas蛋白复合物结合形成具有特殊功能的Cas/crRNA作用复合体，在干扰阶段发挥作用[9]。

干扰阶段：当宿主再次接触到外界噬菌体或质粒时，crRNA便会与其同源的外源核酸特异性结合，而后通过Cas/crRNA作用复合体将外源核酸切割成碎片，使其无法行使功能，从而达到保护宿主基因组的目的[9]。

4 CRISPR/Cas9系统的应用

4.1 原始的Cas9介导的基因编辑

此过程主要分为两步：①在特定的区域由crRNA中的20nt的靶位对目标序列进行识别，而后被Cas9切割产生DB S[11]。②由修复系统对DBS进行修复。主要有NHEJ和HDR两种修复方式。NHEJ作为有错误倾向的过程，经常产生非限制性的小的插入或者缺失，从而导致功能的异常。HDR修复则表现为精确的编辑，它们会产生限制性的缺失、插入或者是核酸的替代[12]。在此之前，首先它们要在外来的宿主中表达。不同物种、不同组织器官表达差异很大[13]。

4.2 核酸内切酶介导的基因编辑

伴有RUVC和HNH突变的RNA指导的Cas9n具有在目标区产生的是单切口[14]。这种切口可以通过HDR途径非常成功的进行修复编辑[15]。引入一对gRNA指导性的CAS9n产生的DSBs可以通过NHEJ产生突变，较单一的Cas9n介导的HDR效率显著提高，且可以改善人类细胞的脱靶率高达50～1500倍。因为双切口产生的可预测的有限制黏性末端，通过NHEJ介导的连接，可以提供有兼容的突出末端的双链修复模板，也可以成功的将HDR非依赖的片段在特定区域整合[13]。因此利用Cas9n多个切口的产生可以进行更高精准度的基因编辑[13]。

4.3 非活化的Cas9为基础的转录调控

CRISPR/Cas系统也被发展成为在不改变目标基因序列的基础上的一种新型的便捷的多种途径重复使用的转录调控方式，被称作CRISPR干扰[16]。由完全灭活的dCas9和特定的gRNA（或者是tracrRNA：crRNA复合體）组成。它虽失去了核酸内切酶的活性，但与gRNA结合和与目标序列的绑定的能力并不受影响。和RNAi一样，其取决于碱基配对的互补性对目标部位的识别。RNAi主要引起转录本的降解和或者翻译的受阻。但是CRSPRi阻止了转录的起始和延伸[17]。通过设计多对gRNA，使同时调节多基因成为可能。dCas9介导的转录调控在肺炎链球菌中得到验证，联合两个gRNA同时作用同一基因可能使沉默效率达到1000倍。因此，CRISPRi在基因转录水平调控基因表达是非常有前景的通用方法。

4.4 以Cas9为基础的高通量正向遗传筛查

截至目前，所有以Cas9为基础的工具都显示出有强大的加强各种遗传及合成生物学的能力。鉴于此，利用多功能的Cas9各种相关产物创建突变库，用来检测或者鉴定与遗传要素有关的基因谱的表现型是非常有可能的[18]。为了得到高通量的目标序列，构建高度特异性的gRNA库是非常重要的。让原始的Cas9和gRNA在宿主中共表达可以产生丢失功能的突变库[19]。如果dCas9或者有Cas9效应的嵌合体被应用，可以产生基因敲低或者激活引起突变。相比于失去功能的突变库，这些突变在研究致死基因上有难以比拟的优势[20]。

4.5 CR.ISPR/Cas9应用的影响因素

影响Cas9基因编辑工具效率和特异性的因素众多。比如：Cas9的活性、RNA组成的长度和结构、Cas9/RNA的比例、RNA目标序列的互补程度和互补的部位。熟悉这些影响因素有助于指导和改进以后CRISPR的实验[21]。

4.6 与其它基因编辑工具的比较

用来基因靶向编辑和调节基因表达的工具根据它们靶向识别的机制，被分成针对特异性蛋白和核苷酸两大组。锌指和TALENs是众所周知的方法。较上述方法Cas9具有以下优势：①只需合成1个sgRNA就能实现对基因的特异性修饰，Cas蛋白不具特异性。②编码sgRNA的序列不超过100 bp，比构建TALENs和ZFNs更简单方便。③较短的sgRNA序列也避免了超长、高度重复的TALENs编码载体带来的并发症。但是，它同样存在脱靶的局限性，为了提高Cas9为基础的工具效率和特异性，更需要在Cas9工程、优化gRNA选择规则中付出力度，并进一步阐明Cas9基因组识别特征。

5 CRISPR/Cas9系统在脑胶质瘤中的应用

随着对该编辑系统的深入了解，人们开始不断将其应用于对脑胶质瘤的研究方面。通过体内、体外敲除脑胶质瘤中的EGFR，发现CRISPR/Cas9对于富含EGFR或者是EGFR突变的患者来说都具有很好的治疗前景[22]；同时敲除小鼠大脑中Trp53、Pten、Nf1等基因可以促进脑胶质瘤的发展，进一步证实这些抑癌基因在脑胶质瘤发生、发展过程中的重要作用[23]；对脑胶质瘤干细胞中特定基因的敲除，再次证实了了肿瘤干细胞是肿瘤发生的种子[24]；MiR-10b及MiR24-3p基因的敲除揭示了MiR参与调控了脑胶质瘤的增殖及侵袭的特性[25]；转座子PiggyBac与CRISPR/Cas9的结合使得脑胶质瘤中的突变可能得到纠正[26]；高通量正向筛查为脑胶质瘤化疗耐药的筛选提供了更便捷的方法[27]，通过对脑胶质细胞中CXCR4及PYK2等基因的敲除，发现这些基因在脑胶质细胞的生长、迁移及侵袭能力的影响方面发挥着重要作用，敲除这些基因后细胞的生长、迁移、侵袭能力较野生型细胞明显下降。不同级别的脑胶质有着不同的基因突变类型，同一级别不同患者之间也存在着不同遗传基因的突变，依据这些突变可以将胶质瘤分为不同的基因亚型，不同亚型之间的预后存在差异，估要想做到个体化治疗，必须先了解患者的基因亚型。总之，利用该编辑系统，可以对脑胶质瘤中的特定基因或者多个进行精准的编辑，探讨其功能及调节机制，也可以利用转座子或者引入模板序列对突变位点进行修复，还可以进行大量药物的筛选，为脑胶质瘤的综合治疗提供非常重要的帮助，为开发新药提供理论基础。

6 小結

Cas9具有明显的优点，是目前广泛使用的靶向工具不能比拟的。它大大提高在不同的生物体中设计和编辑基因和调节基因的表达的能力；为更容易区分出个体化基因功能铺平了道路；也将加快对体内冗长的基因的功能和表观遗传学研究；使得多基因的编辑变得更高效、简单，应用领域非常广泛。尽管以Cas9为基础的研究工具已被应用在许多模型生物中，但包括分子结构和Cas9的催化机制，PAM的依赖性和gRNA加载机制的几个基本属性尚不清楚。了解这些问题将有助于使Cas9编辑工程独立于PAM之外，扩大我们的选择目标，并产生高度精确的Cas9 gRNA的复合物，特别是用作人类治疗剂。目前所面临的主要挑战是脱靶的控制。上述工具是解决这一问题有效的方法[28]。此外，通过高通量的方法全面分析脱靶事件将有助于建立目标序列的选择规则、设计和编写程序。以下几个方面尚需要进一步评估包括：①GC含量和设计的gRNA二级结构的影响，Cas9/gRNA分子在编辑和沉默效率、特异性上的比率；②不同输送系统激活Cas9的效果和不同细胞中gRNA的组成；③NHEJ和HDR介导的DSB修复在不同生物中的普遍性和有效性，尤其是在细菌中；④Cas9为基础的工具，基于高通量的前遗传学研究的潜在的应用[29]。该工具在脑胶质基因治疗方面的研究和利用尚处在初始阶段，要充分了解Cas9为基础的工具并将它们广泛应用于脑胶质瘤的临床治疗尚需花费更多的精力。

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