谭烈明 邓艺燕

手足口病（hand，foot and mouth disease，HFMD）是儿童常见的传染性疾病，该病于5岁以下儿童多发，以手、足、口多发疱疹为主要特征，病情发展快，可导致个别重症患儿死亡［1］。目前已有20多种肠道病毒可引发手足口病，最为常见的是肠道病毒71型（enterovirus 71，EV71）和柯萨奇病毒A16型（coxsackievirus A16，CA16）引起［2-4］，并且在全球多次大规模爆发流行。近年来，HFMD的病原除主要型别外，由其他型别所引起的HFMD，也逐渐被认识。为了解玉林市HFMD的主要病原谱构成，现对玉林市红十字会医院2014年1月至2017年12月共32 077例HFMD临床送检标本的病原学检测结果进行分析，为手足口病防治提供依据。

1 资料与方法

1.1 资料来源

采集2014年1月-2017年12月临床诊断为HFMD患者的肛拭子标本共32 077例，其中男性19 505例，女性12 572例，年龄10天至73岁，平均年龄（2.1±0.02）岁。

1.2 方法

1.2.1 标本采集

由护士或医生采集标本，采集前由专业人员对采集规范进行培训。肛拭子：可用棉签由肛门插入直肠内采取，使拭子变成湿润并染有一些粪便颜色。将棉签放入内装有2 mL生理盐水的采样管中并保存于2～8℃冰箱。

1.2.2 病毒RNA提取

使用中山大学达安基因股份有限公司提取试剂盒（离心柱提法）提取RNA，充分混匀标本后，取100 μL加入50 μL的蛋白酶K和200 μL的裂解工作液，72℃10 min，加入250 μL乙醇，混匀后，全部移入离心柱中，离心，纯化，洗脱，提取好的RNA可以直接用于检测，也可存于-20℃，24 h内完成检测。

1.2.3 荧光定量PCR核酸检测

使用中山大学达安基因股份有限公司提供的荧光定量PCR试剂盒（PCR-荧光探针法），反应体系：RT-PCR反应液15 μL、逆转录酶2 μL、Taq酶3 μL；上述PCR反应管中分别加入处理后的阴性质控品、待测样品混浊液、阳性质控品各5 μL，3 000 r/min离心30s，放入PCR扩增仪。在瑞士罗氏cobas480实时荧光PCR仪器上进行RNA检测，具体反应条件参照试剂盒说明书。

1.2.4 结果判断

阴性质控品：无典型S型扩增曲线或无Ct值；阳性质控品：呈典型S型扩增曲线且Ct值≤30；如果检测结果无典型S型扩增曲线或Ct值＞34.9，则判断标本为阴性；如果检测结果呈典型S型扩增曲线且Ct值≤34.9，则判断标本为阳性。

1.3 统计学处理

采用SPSS 24.0软件进行数据分析处理，采用χ2检验对结果进行比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病原谱构成

共检测32 077份标本，其中肠道病毒阳性率为80.1%（25 870/32 077），其中EV71型阳性检出率为12.4%（3 203/25 870），CA16型阳性检出率为5.4%（1 402/25 870），非EV71/CA16型阳性检出率为82.2%（21 265/25 870）。4年间，非EV71/CA16型的阳性与EV71型和CA16型的比较差异有统计学意义（χ2=2 851.99，P=0.000，P＜0.01），见表1。

表1 2014 -2017年玉林市各年手足口病核酸检测结果Table 1 Results of nucleic acid detection of hand，foot and mouth disease in Yulin City，2014-2017

2.2 实时荧光定量PCR检测结果

阳性检测结果的扩增曲线呈典型S型扩增曲线且Ct值≤34.9。阴性检测的结果无典型S型扩增曲线或Ct值＞34.9（图1，图2）。

图1 荧光定量PCR检测曲线Figure 1 The curve of RT-PCR

2.3 年龄分布特征

从年龄分布来看，玉林市2014至2017年发病年龄最小为10 d，最大为73岁，发病的人群以5岁以下儿童为主，占97.97%（25 345/25 870）。其中0～3岁儿童发病最多，占总病例数的89.98%（23 278/25 870）。CA16型和EV71型的阳性率在所有年龄组间比较，差异无统计学意义（χ2=5.48，P=0.48，P＞0.05）。非EV71/CA16组与CA16组、EV71组在各年龄组中分别比较，差异具有统计学意义（χ2=424.35，P=0.000，P＜0.01），见表2。

图2 荧光定量PCR检测曲线图Figure 2 The curve of RT-PCR

2.4 性别分布

手足口病病毒在男性与女性之间的阳性率比较，差异无统计学意义（χ2=0.093，P=0.955，P＞0.05），说明病毒感染在不同性别患者中的感染情况无差异，见表3。

表2 2014 -2017年玉林市手足口病各年龄段分布情况Table 2 Distribution of hand，foot and mouth Disease by age in Yulin City，2014-2017

2.5 月份分布特征

2014-2017年各月均有发病，发病具有明显的季节性，呈双峰型分布。4月开始上升，随后的5～7月持续处于高发水平，此为春夏高峰，是发病的最高峰。自7月开始病例数逐渐递减，进入9月后病例数开始反弹上升，为发病的次高峰。春夏高峰的流行周期长于秋冬高峰（图3）。

表3 2014 -2017年玉林市手足口病患者性别的分布情况Table 3 Gender Distribution of hand，foot and mouth disease in Yulin City，2014-2017

图3 2014 -2017年不同月份手足口病发病人数分布Figure 3 The incidence of HFMD in different months from 2014 to 2017

3 讨论

手足口病在我国流行强度较大，自2008年以来全国很多地方爆发过较大规模，已成为危害我国儿童健康的重要公共卫生问题［5］。因此对于流行季节的实验室诊断，采用简便、快捷、准确的技术则是实验室诊断的关键。qPCR是将PCR技术和荧光检测技术结合起来实现了对核酸的自动化检测的技术，其原理是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用PCR对DNA的高效扩增，运用高特异性的探针和高敏感性的光谱技术检测目的片段及定量。因此荧光定量基因检测方法可准确、灵敏地反映感染数量和治疗恢复情况，对手足口病早期诊断和疗效的观察具有重要的指导作用。

本文通过对玉林市2014-2017年手足口病病原体流行特征监测发现，玉林市手足口病全年均可发病，且发病存在季节性变化，病例主要集中在4～9月，这与胡跃华、孙军玲等［6-7］报道的手足口病在夏、秋季均有明显流行高峰一致。玉林市2014-2017年手足口病的发病人群为主要是5岁以下儿童，其中0～3岁儿童发病数最多，此结果与刘莹莹、杭惠等［8-10］报道的结果相符，该现象可能与人群免疫水平及个人卫生习惯有关，5岁以下儿童免疫水平较低，卫生意识淡薄，容易受到各种细菌病毒入侵，疾病感染的风险增大。故儿童在0～3岁时发病最多，5岁后较少。从性别来看，男童发病例数高于女童，可能与男童好动，活动范围较女童广，个人卫生习惯不如女童有关。因此，在每年夏、秋季加强对5岁以下儿童，尤其是0～3岁男童的手足口病防控，可有效控制手足口病的蔓延。

叶瑞国等［11］报道2012年玉林市手足口病主要以EV71型和CA16型为优势流行毒株。本研究发现2014年EV71型阳性率为29%，CA16型为7.5%，非EV71/CA16型阳性率为63.5%。并且2015-2017年非EV71/CA16型肠道病毒所占的比例逐渐增加，比率从63.5%升至90.7%。说明从2014年起玉林市流行季HFMD的肠道病毒感染已从EV71型和CA16型占主要，改变到非EV71/CA16型成为主要流行株，与朱俊萍、关恒云等［12-13］报道的手足口病病原研究结果基本一致，和国内外有关报道相似［14-15］。目前，国内有关HFMD致病机制和预防治疗关注的焦点主要集中于EV71型和CA16型2种病原，但是近年来国内很多地方报道EV71和CA16型感染比率已经减少，其它型别肠道病毒在HFMD流行中所占比例明显增加。从2010年起，陈前进、赵虹等［16-18］陆续报非EV71/CA16型病毒株逐渐在国内HFMD中逐渐成为优势流行病毒株。廖琳虹、邱惠芳等［19-23］也发现其他肠道病毒感染成为HFMD的重要组成部分。目前，玉林市手足口病常规的病原学检测仅针对肠道病毒通用、EV71型和CA16型，而非EV71/CA16型病毒株逐渐成为引发手足口病暴发流行的优势菌株，为了预防和控制手足口病的暴发流行，下一步要对非EV71/CA16型病毒株进行基因分型，期待更多肠道病毒分型产品应用于临床。

因此，加强对玉林市手足口病其他型别病原体的监测，确立更为精确、全面的肠道病毒分型，建立并完善玉林市手足口病详细病原谱，把握手足口病病原体流行趋势，可为今后手足口病的诊治、日常监测和防控工作提供科学依据。