贾琴妹孙乐满宝华★

普罗威登斯菌属（Providencia）肠杆菌科细菌，是肠道中正常菌群之一。该菌属在自然界中分布广泛，属于条件致病菌。普罗威登斯菌属包括产碱普罗威登斯菌（Providencia alcalifaciens，P.alcalifaciens）、斯氏普罗威登斯菌（Providencia stuartii，P.stuartii）、雷氏普罗威登斯菌（Providen-cia rettgeri，P.rettgeri）、鲁氏普罗威登斯菌（Providencia rustigianii，P.rustigianii）和亨巴赫普罗威登斯菌（Providencia heimbochae，P.heimbochae）。雷氏普罗威登斯菌极易在食品的加工、运输、销售等过程中大量繁殖而导致肠道感染和食物中毒［1］。此外，国内外还有该菌引起的旅行者腹泻、眼部感染、菌血症、尿路感染等相关报道［2-3］。本文将报道1株来自足部感染的耐碳青霉烯类雷氏普罗威登斯菌及其耐药机制，从而来加强医务人员的认识，意识到合理使用抗菌药物的重要性。

1 材料和方法

1.1 临床资料

患者，男性，60岁，因“右足踇趾红肿半月，发黑、流脓、发热3 d”入住云南省第三人民医院。专科检查：右足背稍肿胀，色素沉着，踇趾发黑，恶臭，踇趾根部掌侧见鸽子蛋大小软组织缺损，见踇趾屈肌腱，无明显渗出，踇趾部分功能存在，感觉消失，余各指感觉稍减退。既往有糖尿病史20余年。入院检查：血生化示血糖9.8 mol/L；尿常规示葡萄糖2+，酮体阴性；血常规示白细胞12.16×109/L、中性粒细胞占72%；予抗炎和降血糖治疗。踇趾根部掌侧渗出液培养示雷氏普罗威登斯菌，治疗5 d后，再次培养，结果无细菌生长。继续治疗7 d后，所有症状好转，给予出院。

1.2 菌株来源

分离得到的雷氏普罗威登斯菌源于云南省第三人民医院内分泌科某糖尿病患者右足踇趾根部掌侧溃破处。质控菌株为大肠埃希菌（ATCC25922），购自国家卫生计生委临床检验中心。

1.3 仪器与试剂

VTEK 2 Compact全自动微生物鉴定仪及配套鉴定/药敏卡购自法国生物梅里埃公司生产；CO2培养箱购自美国Thermo公司产品；旋涡混合器VDRTEX-5购自海门其林贝尔仪器制造有限公司；PCR扩增仪购自美国PE公司；电泳仪购自美国Tanon公司；紫外凝胶成像仪购自上海复日生物技术有限公司。

1.4 菌株的分离培养、鉴定与体外药物敏感性试验

无菌采集患者足部感染灶中分泌物样本，接种于血琼脂平板、麦康凯琼脂平板和巧克力琼脂平板等（郑州安图生物有限公司生产），置CO2温箱37℃孵育24 h。随后挑取纯菌落，采用Vitek 2 Compact全自动微生物鉴定仪及配套鉴定卡/药物敏感性卡，进行菌种鉴定和体外药物敏感性试验，确定其最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）值。同时采用美国临床实验室标准化协会（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推荐的纸片扩散法（英国Oxoid公司产品）来补充药物敏感性卡中没有覆盖到的抗菌药物。

1.5 碳青霉烯酶表型的检测

1.5.1 改良Hodge实验（modified Hodge test，MHT）方法

将0.5麦氏浊度的大肠埃希菌（ATCC25922）菌悬液进行1∶10稀释后均匀涂布于水解酪蛋白胨琼脂平板上，待其干燥后将厄他培南纸片置于平板正中心；使用接种环挑取菌落从纸片边缘向平板边缘垂直划线，37℃孵育16～18 h观察结果。如果在被测菌株与大肠埃希菌（ATCC25922）抑菌圈交汇处，大肠埃希菌生长增强，即产碳青霉烯酶。

1.5.2 乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetra acetic acid，EDTA）协同实验

将0.5麦氏浊度的待检菌悬液涂布于水解酪蛋白胨琼脂平板上，待其干燥后将亚胺培南（10 μg）纸片置于距离EDTA纸片（4 μg）1 cm平板表面，37℃孵育16～18 h观察结果。当亚胺培南抑菌圈在靠近EDTA纸片侧明显扩大者为产金属类碳青霉烯酶。

1.6 碳青霉烯酶耐药基因检测

根据文献报道合成聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）引物，引物序列见表1，包括最为常见的KPC酶和金属β-内酰胺酶（MBLs）IMP、VIM、NDM-1以及苯唑西林酶OXA-48［4-5］。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，阳性PCR产物送上海生工公司测序。

2 结果

2.1 体外药物敏感性试验

雷氏普罗威登斯菌对氟喹诺酮类、大部分氨基糖苷类、β-内酰胺类抗菌药物耐药，对阿米卡星敏感，见表2。

表1 编码碳青霉烯酶耐药基因引物序列及扩增片段长度Table 1 The drug resistance gene primer sequence and amplification fragment length of carbapenemases

2.2 碳青霉烯酶表型检测结果

改良Hodge试验阳性，见图1。

EDTA协同试验阴性，见图2。

2.3 碳青霉烯酶耐药基因检测结果

通过对KPC、IMP、VIM、NDM-1、OXA-48共5种常见碳青霉烯酶基因的扩增，blaKPC为阳性，其余均为阴性，见图3。测序结果显示检出的KPC与KPC-2有99%同源（GenBank登录号：FJ628167）。

3 讨论

表2 雷氏普罗威登斯菌药物敏感性结果Table 2 The results of the drug sensitivity of Providencia rettgeri

由于抗菌药物不合理不规范的广泛应用，再加随后的“王牌”抗菌药物——碳青霉烯类药物备受临床青睐，用量增多，导致多重耐药及泛耐药细菌日趋严重，其中耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌（carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CRE）是重要组成成员之一，给人类健康带来严重的威胁。CRE主要的耐药机制是产碳青霉烯酶，目前国外最流行的主要有KPC、IMP、VIM、NDM酶［6-7］，而国内主要流行的为KPC和IMP酶［8］，新德里金属 β 内酰胺酶-1（NDM-1）也有散在报道［9］。KPC型酶是一种几乎能水解所有β-内酰胺类抗菌药物的A类水解酶。2001年首次由Yigit等［10］在美国北卡罗纳州从肺炎克雷伯菌中发现KPC-1型，2003年KPC-2型在马里兰从肺炎克雷伯菌中发现。2004年我国首次在浙江大学医学院附属第一医院从肺炎克雷伯菌中发现了KPC酶［11］。目前为止，GenBank已记录的KPC型酶有14亚种，全球范围内报道的KPC型酶多以KPC-2型和KPC-3型为主，国内以KPC-2型为主，且产KPC型酶的细菌以肺炎克雷菌为主。本报道中检测到的碳青霉烯酶就是国内主要流行的KPC-2型，未检测到IMP、VIM、NDM-1、OXA-48型等，且产酶菌株是从糖尿病足患者踇趾根部掌侧渗出液中分离培养出来的雷氏普罗威登斯菌，此菌属肠杆菌科细菌。从本文药物敏感性实验结果可知这株雷氏普罗威登斯菌已是泛耐菌，其耐药机制除了产KPC-2型酶外，可能还存在其他的耐药机制，如：膜孔蛋白缺失、高水平产生头孢菌素酶（AmpC）或突变联合ESBLs、外排泵的过度表达等［12］，其中产生碳青霉烯酶KPC-2可能是这株菌最主要的耐药机制。同时，从本报道可知产碳青霉烯酶的细菌不仅仅局限于肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌和鲍曼不动杆菌复合菌等分离培养较常见的细菌，而是细菌种类在向多样化方向发展，且存在着向不常见细菌种类蔓延趋势，这不单说明是产酶菌株种类在逐年涌现，更体现了碳青霉烯酶耐药基因可能在细菌之间存在水平传播或全球范围的扩散，所以医务人员应加强警惕，防止局部流行或爆发感染。

图1 改良Hodge实验检测碳青霉烯酶Figure 1 The modified Hodge test of detection carbapenemases

图2 EDTA协同实验检测碳青霉烯酶Figure 2 EDTA collaborative test of detection carbapenemases

图3 PCR扩增雷氏普罗威登斯菌碳青霉烯酶耐药基因Figure 3 PCR amplification resistance gene of carbapenemases of Providencia rettgeri

雷氏普罗威登斯菌主要分离自人的尿液、血液或痰液，很少分离自分泌物样本。本报道中雷氏普罗威登斯菌不仅感染部位及来源特殊，而且产碳青霉烯酶，在国内相关文献报道中也是较少见，但也偶有报道［13］产NDM-1及ESBLs的雷氏普罗威登斯菌，如：2011年我国广东省某三甲医院从患者肝脓肿引流液中分离出一株产碳青霉烯类酶NDM-1型的雷氏普罗威登斯菌［14］，除此之外至今未见其它相关的报道。国外已有多篇文献［15-17］报道雷氏普罗威登斯菌属可产生IMP-1型金属β-内酰胺酶以及各种β-内酰胺酶，如CTX-M-15、VEB-1a和PER-1型ESBLs和ArmA型16SrRNA甲基化酶等［18］。这说明国内国外对这种不常见菌株都面临着耐药性升高的难题，具体原因还需结合当地情况分析，找到有效的解决方法与措施，控制其继续传播。

近几年，国内外相关普罗威登斯菌属的报道在不断增多，其耐药问题应引起足够的重视，尽量做到防止或减少多重耐药菌株（主要是产碳青霉烯酶菌株）的出现，原因是产碳青霉烯酶细菌感染常伴随高致残率或高死亡率等严重后果，且编码碳青霉烯酶的基因大部分位于可移动基因元件（质粒或转座子）上，可以在不同的种属之间经接合、转导，转染、插入等进行传播［19-21］，而且可通过医疗器械及医务工作者等多种途径在患者间传播和交叉感染，具有局部暴发流行的潜在危害。因此，快速、准确地检测产酶菌株，对于患者的治疗、防止耐药基因的播散具有重要意义，与此同时，医护人员应提高意识，加强全院耐药监测、严格执行手卫生和消毒隔离等措施。本报道也再次敲响警钟：规范合理使用抗菌药物。目前，市场上的抗菌药物已经赶不上细菌的变异速度，新的药物还在研发中，所以全球都面临着受威胁的困难处境。总之，为了全人类的健康，我们呼吁严格使用抗菌药物，加快新药问世的步伐。