李 亮，刘书东，田 聪，梁维维，康 帅，艾克拜尔·阿不都热依木

(新疆畜牧科学院 草业研究所，新疆 乌鲁木齐 830000)

优良饲草料缺乏是畜牧业发展的重要限制因素，特别是北方冷季饲草料短缺，在极端气候年份，对农牧民会造成较大的经济损失，开展饲草料种植与青贮应用可以有效缓解该问题[1]。开展青贮玉米的选育与推广工作，有利于实现粮、饲、经三元结构的有机结合，有利于解决我国畜牧业迅速发展与饲草料短缺的矛盾[2-3]。我国青贮玉米育种工作开展较晚，青贮玉米种质资源的利用率低、种质材料匮乏，创新、筛选并改良现有种质资源是青贮玉米育种的当务之急[4]。种质资源研究是青贮玉米育种的基础，掌握青贮玉米种质资源间的亲缘关系，对选育优良品种具有重要作用。随着分子生物学技术的快速发展，分子标记技术被广泛应用于种质资源鉴定等分析研究，特别是SNP(单核苷酸多态性)芯片技术平台的开发与应用，促进了以SNP为核心的高通量分型技术的发展，推动了玉米、水稻等作物在遗传、种质鉴定、分子育种等领域的发展[5]。SNPs广泛应用于模式动物和模式植物的亲缘关系、品种鉴定等研究[6]。王阳等[7]使用3K的基因芯片对黄早四及14份黄改系进行遗传基础分析，结果显示，14个黄改系与黄早四的相似度比例在90.1%～98.0%。路明等[8]使用SNP标记对玉米品种吉单50的遗传基础进行研究，发现吉单50的母本A5001与599-20遗传关系最近，父本A5002与铁7922的遗传关系最近。史亚兴等[9]使用1059个SNP标记对39份糯玉米自交系的亲缘关系和多态性信息进行研究，明确了39份自交系的最小等位基因频率为0.03～0.50，亲缘关系系数为0.00～0.91，为糯玉米种质资源利用及品种选育打下基础。但青贮玉米种质资源研究较少，种质材料信息存在遗传基础不明确、亲缘关系不清楚，育种工作存在盲目性的问题。试验使用56K的基因芯片对遗传信息不明确的34份玉米种质材料进行分析，期望在分子水平上揭示上述种质材料的亲缘关系，为合理利用上述玉米自交系，以及青贮玉米的遗传选育工作打下基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

34份供试玉米种质材料分为3部分，第1部分为9份籽粒玉米自交系(材料1、6、14、18、21、24、25引种自中国农业科学院作物研究所，材料19引自海南农业科学院，材料22为先玉335亲本自交系)；第2部分为5份青贮玉米自交系(材料2、7、11、15引自海南农业科学院、材料27为大刍草)；第3部分为20份青贮玉米种质资源(未知青贮玉米种质资源)(表1)。

表1 34份玉米种质材料信息

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取 将供试材料种植在新疆呼图壁县农业部旱生牧草原种基地内，正常田间管理，在玉米开花期取新鲜的穗位叶为样品，使用CTAB法提取叶片基因组DNA[10]。使用紫外分光光度计和电泳的方法检测样品是否合格，要求样品无降解、无蛋白质污染和无RNA污染，将符合要求的DNA样品保存在-80℃冰箱中备用(图1)。

图1 部分样品DNA电泳图Fig.1 The part of 34 maize germplasms DNA electrophoretogram

1.2.2 基因芯片杂交 对34份玉米种质资源进行Affymetrix基因芯片杂交(北京中玉金标记有限公司)，芯片检测的SNP标记个数为56 000个(56K)。对34份核酸样品进行质量检测，合格的样品进行线性扩增，加入扩增液后，37℃温浴22～24 h；DNA片段化，用随机内切酶酶切扩增产物；乙醇沉淀DNA，使用高速冷冻离心机收集目标片段，然后加入重悬液和杂交液；对样品进行变性，变性后立即在GeneTitan MC Instrument进行杂交实验；杂交结束后利用GeneTitan MC Instrument进行样品的洗染和扫描；对GeneTitan MC Instrument产生的文件利用Axiom Analysis Suit进行数据分析以获得原始数据。

1.2.3 数据统计分析 使用Admixture软件对数据进行遗传结构分析，使用数据库网站对芯片数据进行亲缘关系分析，确定各种质材料的亲缘关系系数[11-12]。

2 结果与分析

2.1 34份种质材料的遗传结构分析

34份种质材料预期信号与背景信号分辨率值都大于82%，样品数据检出率都大于95%，34份种质材料的平均样品检出率为97.89%(表2)。可见，34份种质材料基因芯片杂交质量较好。34份种质材料分为2种遗传类型，籽粒玉米种质材料1、6、14、18、21、22、24、25属于一类遗传结构类型；青贮玉米种质材料2、12、27属于另一类遗传类型，说明籽粒玉米种质资源和青贮玉米种质资源在遗传学上具有很大的遗传差异，这可能是导致上述两种类型的玉米种质表型差异的主要原因。大部分未知青贮种质资源含有两种类型的遗传结构，其中青贮种质资源的遗传比例相对较大(图1)。

图2 34份材料遗传结构图Fig.2 The genetic structure of 34 maize germplasms注：不同颜色代表不同群体，深色代表青贮玉米，灰色代表籽粒玉米

样品数量数据检出率大于95%信号与背景信号分辨率值大于82%平均检出率34343497.89%

2.2 34份种质材料的亲缘关系分析

34份种质材料中，已知种质材料亲缘关系都较远，其中，种质材料25和27亲缘关系最远，亲缘系数为-8.687 8；大部分未知种质材料具有亲缘关系，种质材料26和34亲缘关系最近，亲缘系数为0.266 3。通过亲缘关系系数的平均值可知，种质材料27的亲缘关系系数平均值最小，说明该材料与其他种质材料的亲缘关系最远，其次是种质材料2。根据各种质材料亲缘关系远近排列，与其他种质材料亲缘关系较远的前5个种质材料分别是27(-5.000 64)>2(-3.300 79)>25(-1.475 92)>18(-1.35237)>15(-1.21794)。说明5个种质材料与其他种质资源具有较大的亲缘差异。

在未知来源的玉米种质中，除种质材料16外，其他都存在一定的亲缘关系。其中种质材料23与15个未知来源的种质材料存在亲缘关系，有10个种质材料与14个未知来源的种质材料存在亲缘关系。有20对种质材料间存在较大的亲缘关系，其亲缘关系系数在0.2以上，25对种质材料间存在一定的亲缘关系，其亲缘关系系数在0.1～0.2。

3 讨论

3.1 青贮玉米种质的遗传结构

掌握种质资源的遗传结构信息是掌握种质材料遗传多样性和亲缘关系的基础。王文斌等[13]使用2846个SNP标记对23份玉米自交系进行分析，发现11个自交系在遗传上更接近丹340、郑58；12个自交系在遗传上更接近Mo17、黄早四。吴承来等[14]使用SSR标记对玉米各类群的遗传关系进行研究发现Reid群与旅大红骨群、PB群的遗传相似系数比较大，而与塘四平头群的遗传相似系数比较小。在籽粒玉米遗传结构研究中种质资源会被划分多个亚群[15]，试验中34份玉米种质资源被分为2种类型，这可能是由于样本数量较少以及籽粒玉米和青贮玉米种质资源在基因组水平上差异过大的原因，这也启示青贮玉米种质资源要保存具有青贮玉米特性的基因资源，避免与籽粒玉米遗传资源大规模混杂，有利于提高青贮玉米选育过程中杂种优势的利用。

3.2 青贮玉米种质的亲缘关系

种质资源的引进、改良、创新是青贮玉米育种的关键，掌握种质资源的亲缘关系和遗传基础是种质创新的前提条件。赵文明等[16]使用92对SSR标记对32份糯玉米自交系亲缘关系进行分析，发现自交系T366与其他自交系的遗传差异最大，亲缘关系最远。史亚兴等[9]使用1059个SNP分子标记对39份糯玉米种质资源的亲缘关系进行研究，发现京6和京糯6之间的亲缘关系系数为0.91；白檽6与BN2次之，亲缘关系系数为0.82，说明2对自交系亲缘关系较近，而且一些未知来源的自交系通过亲缘关系分析也明确了其亲缘关系。这说明通过亲缘关系分析可以准确掌握各种质资源的遗传信息，可以间接反映该种质的遗传背景情况。试验中使用56K基因芯片对34份玉米种质资源进行分析，种质27(大刍草)的亲缘关系最远，通过对5个青贮自交系和未知来源种质资源的亲缘关系进行比较，发现种质2，15和27与未知来源种质的亲缘关系差异较大，而种质11与未知来源种质的亲缘关系差异较小。因此，未知种质资源可能与种质11有一定的血缘关系。种质11有籽粒玉米血缘，但青贮玉米血缘偏多。这可能说明未知的种质资源是籽粒玉米与青贮玉米杂交产生的后代，正在向青贮玉米方向进行选择。种质31和34的青贮玉米血缘较多，籽粒玉米血缘较少(图1)。种质31和34与籽粒玉米自交系21，22和24的亲缘关系差异较小，但与籽粒玉米自交系18、25的亲缘关系差异较大。结合籽粒玉米选育过程中存在杂种优势群A群和B群[17]，可以推测在青贮玉米种质和籽粒玉米种质进行杂交选育二环系的过程中，如果杂交使用籽粒玉米属于已知的一个群，那么后期通过该杂交选育的二环系可能与另一个群体的自交系亲缘关系更远，这为可能青贮玉米的选育和杂交模式利用提供基础。

4 结论

使用56K的SNP标记对34份玉米种质资源进行遗传结构和亲缘关系分析，发现34份玉米种质可以分为2种类型，分别是籽粒玉米和青贮玉米类型，大部分未知青贮种质在遗传结构上具有较大的青贮种质遗传比例，是潜在的青贮玉米种质创新材料；种质材料27、2、25、18、15与其他种质资源的亲缘关系较远，是潜在的育种材料。