陈 阳，孙华山，金一锋，金忠民，陈雅君

(1.东北农业大学 园艺园林学院，黑龙江 哈尔滨 150030； 2.齐齐哈尔大学 生命科学与农林学院 抗性 基因工程与寒地生物多样性保护重点实验室，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

氮素是决定草坪草生长发育的重要因素，直接影响着草坪草的生长情况及观赏价值[1-3]。植物氮素利用效率影响着草坪草的生长，草坪草缺氮植株多呈现黄化、低矮、抗逆能力低等特征[4]。草地早熟禾由于其抗寒、叶色浓绿、分蘖性强、成坪快等优势，广泛应用于我国北方城市园林建设中[5-6]。目前，针对草地早熟禾(Poapratensis)氮素利用的研究主要集中氮素对于生理生化、坪用质量、内源激素含量、病害等影响[7-10]。在植物生长发育过程中，营养元素的多少直接影响到植物的形态建成，氮素为植物体内重要元素，对于大部分植物而言，氮素影响其生长发育，但是，对草地早熟禾解剖结构如何适应氮素调控的变化仍然知之甚少。氮素、碳素为植物体内重要元素，碳氮化合物参与植物一系列生命活动，碳代谢与氮代谢关系密切，相互提供能量与还原力等[11-15]。植物体内C、N含量以及C/N是反映植物碳氮平衡的一项重要生理指标。

试验采用石蜡切片技术观察氮胁迫后的草地早熟禾解剖结构特点，探究解剖结构与氮素相适应的关联；观察氮胁迫下，不同组织中的总C、总N含量，探究氮素调控对于碳氮代谢的影响，综合分析氮素不同浓度对草地早熟禾组织的影响。

1 材料和方法

1.1 材料来源与培育

供试材料为生长两年的黑龙江野生草地早熟禾，将其于含高氮(15 mmol/L)、中氮(CK 7.5 mmol/L)、低氮(1.5 mmol/L)3种不同氮浓度的霍格兰德培养液中培养2个月，NaNO3控制氮素含量，每隔3 d要更换1次营养液以保证养分的正常供应。每个浓度重复5次，取样后保存。

1.2 解剖结构的观察与测定

选取草地早熟禾不同组织部位进行石蜡切片的制作，试验参照已经优化的草地早熟禾石蜡切片制作过程进行。采用50%乙醇+冰醋酸+40%甲醛的FAA固定剂对其固定24 h。采用乙醇逐级梯度脱水后再用无水乙醇脱水5次。采用逐级过渡的方法将材料从纯乙醇中逐渐过渡到纯二甲苯，纯二甲苯更换3次，每次0.8 h。将试验材料浸蜡24 h，期间更换5次纯蜡。将材料进行包埋、切片、展片及贴片一系列操作。试验采用番红-固绿染色法，其中，番红溶液3 h、固绿溶液40 s。石蜡切片制作好后，采用生物光学显微镜40×观察，Motic Images Advanced 3.2显微镜图像分析软件(厦门麦克奥迪生产)进行测量、记录、拍摄植物各典型结构解剖图，再进一步探究不同氮浓度对植株各结构的影响。

1.3 氮素调控对草地早熟禾组织中全碳、全氮含量的测定

选取草地早熟禾不同浓度氮素后组织样本，105℃烘干15 min，并在65℃烘干6～8 h至恒质量，制成粉末。采用PerkinElmer 2400-CHNS/O元素分析仪进行测定，测得全C与全N的含量，每个处理测定3个样本。

1.4 数据统计与分析方法

采用SPSS 22.0软件对相关数据统计分析，用平均值和标准误表示测定结果，分别对同一部位不同氮素处理进行单因素方差分析，并用Duncan法对各测定数据进行多重比较；采用Graphpad Prism 7.0进行制图。

2 结果与分析

2.1 氮素调控对叶的解剖结构的影响

草地早熟禾叶解剖结构包括表皮、维管束、厚壁组织、气腔、叶肉组织。从解剖结构上看到，表皮由长圆形排列更为紧密的单层细胞组成，维管束均匀分布排列，厚壁组织较明显，气孔密集分布于表皮中。对于叶横剖面中的表皮、厚壁组织、气腔、维管束来说，高氮组各组数据均高于中氮组(CK组)、低氮组，即高氮组>中氮组>低氮组。但是高氮组与中氮组(CK组)、低氮组之间存在显著差异(P<0.05)，中氮组与低氮组之间不存在显著差异。通过表1可以观察到，氮可以促进植株叶解剖结构的生长发育且在一定范围内氮浓度越高生长势越好。但高浓度的氮素比低浓度氮素对植物的影响更大，低浓度氮素虽然对植株的生长有一定影响但和正常氮素处理组下无显著差异。

图1 草地早熟禾叶的解剖结构Fig.1 Anatomical structure of leaves of Kentucky bluegrass注：1.表皮；2.维管束；3.厚壁组织；4.气腔.

典型结构高氮中氮(CK) 低氮表皮厚度/μm37.69±1.01a26.81±3.08b25.08±1.88b厚壁组织长度/μm87.82±5.55a60.03±4.57b52.16±2.51b气腔面积/μm217 820.06±2 272.22a12 418.90±989.09b11 924.19±759.19b维管束面积/μm219 125.39±899.93a12 059.53±961.01b10 845.08±1 695.95b

注：数据为平均值±标准误，样本数量=3，同行不同小写字母表示差异著性(P<0.05)

2.2 氮素调控对茎的解剖结构的影响

选定草地早熟禾茎的表皮厚度、厚壁组织长度、气腔面积、维管束面积4项指标对草地早熟禾不同氮处理后的形态结构进行了观察和测定，可以看到，草地早熟禾茎部解剖结构包括表皮、维管束、厚壁组织、气腔、 气孔、叶肉组织(图2)。茎顶端部分组成较简单，最外层的气腔所占面积较大。对茎部横剖面中的表皮厚度进行比较得出，高氮组>中氮组(CK组)>低氮组，并且3组之间存在显著差异(P<0.05)，对于茎顶端横剖面中的厚壁组织长度、气腔面积进行比较，高氮组>中氮组>低氮组，但高氮组与中氮组(CK组)、低氮组之间存在显著差异(P<0.05)，中氮组与低氮组之间无显著差异。对于茎顶端横剖面中的维管束来说,高氮组>中氮组>低氮组，但高氮组与中氮组之间不存在显著差异，其高氮组与低氮组存在显著差异(表2)。

图2 草地早熟禾茎解剖结构Fig.2 The anatomical structure of the stem of Kentucky Bluegrass注：1.表皮；2.维管束；3.厚壁组织；4.气腔

2.3 氮素调控对根颈的解剖结构的影响

从草地早熟禾根颈的解剖结构组成中可以看到(图3)，其排列统一的表皮结构，维管束精密排列成一圈，中间为髓腔。其中，维管束生长完全，由韧皮部、气隙、环纹导孔、筛管、木质部组成。对于不同氮素处理后的草地早熟禾根颈横剖面中的表皮厚度、厚壁组织长度、同化组织长度、维管束面积4项数据比较分析得到，高氮组>中氮组(CK组)>低氮组，高氮组与中、低氮组之间存在显著差异(P<0.05)(表3)。

图3 草地早熟禾根颈的解剖结构Fig.3 The anatomical structure of rhizome of Kentucky Bluegrass注：1.表皮；2.同化组织；3.维管束；4.薄壁组织；5.厚壁组织

典型结构高氮中氮(CK) 低氮表皮厚度/μm48.90±2.18a40.91±1.37b29.66±1.53c厚壁组织长度/μm60.75±4.98a45.66±2.24b36.70±3.91b气腔面积/μm248 728.10±1 329.47a31 660.89±3 120.87b28 097.96±2 960.68b维管束面积/μm217 783.56±1 386.49a14 471.43±1 204.66ab11 465.04±716.48b

注：同行不同小写字母表示差异显著(P<0.05)

2.4 氮素调控对草地早熟禾组织中全碳、全氮的含量及C/N的影响

在不同浓度的氮处理下，草地早熟禾组织部位的总氮含量均呈叶部最多，根颈部位最少的特征。3个部位的总氮含量随着氮素浓度的降低而减少，其中叶部变化明显(图4)。在高氮、中氮处理下，不同部位的总碳含量为，根颈>叶>茎；但在低氮处理后总碳含量为，叶>茎>根颈(图5)。3个部位的总碳含量均随着氮素浓度的降低而减少。氮胁迫下草地早熟禾不同组织部位的C/N为根颈>茎>叶，在高氮、中氮处理下，叶、茎的C/N变化不大，但根颈的C/N随着氮浓度的降低而升高(图6)。

表3 不同氮处理后草地早熟禾根颈横切面各结构的差异分析

注：同行不同小写字母表示差异显著(P<0.05)

图4 氮胁迫下草地早熟禾不同组织 部位的总氮含量Fig.4 Total nitrogen content in different tissue parts of Kentucky Bluegrass under nitrogen stress

图5 氮胁迫下草地早熟禾不同组织 部位的总碳含量Fig.5 Total carbon content in different tissue parts of Poa pratensis under nitrogen stress

3 讨论

氮素是植物的生命元素，作为肥料的三要素之一，被广泛应用于各种农作物和园林植物的栽培中。当有足够的氮素时，植物体内能产生更多的蛋白质，促进植物细胞的分裂、分化和同化物的积累，使植物的叶片面积、净光合速率增大[16-17]。当氮素不足时，植株弱小，叶色发黄，生长速率变慢，增施氮肥后可明显提高植物生长发育水平。碳氮平衡影响植物营养生长与生殖生长，碳、氮含量及C/N的变化作为观察碳氮同化过程的重要指标之一。有研究者发现氮素调控对紫花苜蓿幼苗根系解剖结构有一定影响，施氮可显著促进其维管束的生长发育[18]，氮素调控草地早熟禾生长中，根颈部位随着氮素浓度增加有利于维管束的生长。研究结果发现，根颈部位的总C含量随着氮浓度的增加随之提高，这可能是由于充足的氮源有助于碳氮代谢过程，并且将光合产物源源不断的通过韧皮部运输到根颈部，进一步促进根颈解剖结构中维管束、厚壁组织的生长。叶、茎、根颈3个部位的表皮、厚壁组织、维管束面积在高浓度氮素营养培养下，其数值均明显大于中氮、低氮培养，高浓度氮培养下可能有利于草地早熟禾的解剖结构的生长，这与紫花苜蓿、玉米、水稻等[19]充足的氮源有利于植物的生长的结果相似。研究不仅限于单一观察氮素调控对于草地早熟禾解剖结构的影响，通过结合碳氮含量的测定，观察氮素充足时解剖结构的变化与碳氮平衡之间的关联，当氮素高浓度供给时，有利于碳水化合物的合成，总C含量较高，草地早熟禾高氮组的解剖结构生长由于低氮组，但C/N随着氮浓度增加反而降低，这表明在低的氮素养分条件下，植物的生长虽然缓慢，但氮素养分利用效率较好，具有高的C/N，这与藏北高寒草地植物碳氮特征[20-21]的研究结果一致。因此，多角度了解草地早熟禾植株生长、C∶N化学计量特征与外界氮素环境因素的影响，为进一步探究草地早熟禾如何高效利用氮素奠定基础。

图6 氮胁迫下草地早熟禾不同组织部位的C/NFig.6 C/N ratio of different tissue parts of Kentucky Bluegrass under nitrogen stress

4 结论

充足的氮素有利于草地早熟禾解剖结构的生长发育，高浓度氮素调控下的叶、茎、根颈中的表皮厚度、厚壁组织长度、气腔面积、维管束面积等指标均大于中氮、低氮组。草地早熟禾3个部位的总氮、总碳含量随着氮素浓度的增加而增多，相同氮素调控下，草地早熟禾不同部位的C/N为，根颈>茎>叶。