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蛇孢菌素A对人直肠癌细胞生长的抑制作用及其机制研究*

2018-09-18黄益领

胃肠病学 2018年8期
关键词:线粒体试剂盒直肠癌

黄益领 陈 湧

浙江省平阳县人民医院普外科1(325400) 岳阳市二人民医院普外科2

背景:蛇孢菌素A(OphA)是一种由双极霉属真菌产生的二倍半萜化合物,已被证实在多种实体瘤中具有抗癌效应,但其在直肠癌中的作用尚不明确。目的:研究OphA对人直肠癌细胞生长的抑制作用及其可能作用机制。方法:体外人直肠癌细胞株SW480经OphA和(或)活性氧簇(ROS)清除剂N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)作用后,以光学显微镜观察细胞形态,MTT实验检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡和ROS表达,蛋白质印迹法检测线粒体凋亡途径相关蛋白表达和NF-κB活化情况。结果:OphA可剂量依赖性地抑制体外SW480细胞增殖,诱导细胞凋亡,促进细胞内ROS表达,细胞色素C、cleaved caspase-3、NF-κB抑制蛋白α(IκBα)表达上调,Bcl-2、p-NF-κBp65表达下调。以NAC清除ROS可明显阻断OphA对SW480细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用,同时逆转上述相关蛋白表达。结论:OphA可能通过ROS介导线粒体途径细胞凋亡,抑制人直肠癌细胞生长。NF-κB信号通路可能参与了ROS介导的细胞凋亡的调控。

蛇孢菌素(ophiobolin, Oph)是一类具有三环或四环结构的二倍半萜类化合物,主要由侵染农作物的双极霉属真菌产生,具有抑制植物胚芽鞘、根系生长和种子萌发等植物毒性作用,其作用机制与破坏细胞膜通透性、减少光合作用和抑制核酸合成有关[1-2]。随着越来越多的Oph被分离和鉴定,现已发现Oph除对细菌和线虫具有杀灭作用外,还能有效抑制HIV和多种肿瘤细胞生长,从而为新型抗癌药物的研发提供了思路[3]。

在目前已发现的45种Oph同系物中,以OphA的细胞毒性最强,可有效抑制恶性胶质瘤[4]、黑色素瘤[5]等多种实体瘤肿瘤细胞生长,诱导细胞凋亡。然而,目前尚未见关于OphA抗直肠癌活性的研究报道。本研究旨在探讨OphA对人直肠癌细胞生长的抑制作用及其可能作用机制,为OphA用于直肠癌的治疗提供实验依据。

材料与方法

一、细胞株和主要试剂

人直肠癌细胞株SW480购自中国医学科学院血 液学研究所。OphA(>95%, AdipoGen Life Sciences)以乙醇配制成2 mmol/L的母液,使用前以PBS稀释。DMEM高糖培养基、胎牛血清(Thermo Fisher Scientific);N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)(Sigma-Aldrich Co.);MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒、Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司);细胞色素C、cleaved caspase-3、Bcl-2、β-actin抗体(Abcam plc.);磷酸化NF-κBp65(p-NF-κBp65)、NF-κBp65、NF-κB抑制蛋白α(IκBα)抗体(Santa Cruz Bio-technology);羊抗兔 IgG-HRP、羊抗鼠 IgG-HRP、PBS、DMSO(上海碧云天生物技术有限公司);活性氧簇(ROS)检测试剂盒、RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

二、方法

1. 细胞培养:SW480细胞使用DMEM高糖培养基(含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、2 mmol/L谷氨酰胺),培养于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中。细胞生长至80%~90%融合度时,以适量0.25%胰蛋白酶消化传代,传代比率为 1∶6。

2. 实验分组:实验分两部分进行。第一部分实验中,细胞分为四组,分别予PBS和1、5、10 μmol/L OphA作用24 h。第二部分实验中,细胞分为对照组、NAC组、OphA组和NAC+OphA组,分别予PBS、NAC(3 mmol/L)、OphA(5 μmol/L)和NAC+OphA作用24 h。

3. MTT实验:调整细胞密度为5×104/mL,以每孔90 μL细胞悬液接种于96 孔培养板,孵育过夜后加入10 μL含OphA和(或)NAC的药液,使OphA终浓度分别为1、5、10 μmol/L,NAC终浓度为 3 mmol/L,置于细胞培养箱中继续孵育24 h,倒置显微镜(奥林巴斯IX83)下观察细胞形态。根据试剂盒说明书,每孔加入MTT试剂20 μL作用4 h,吸去培养基后每孔加入200 μL DMSO,使用酶标仪测定波长570 nm处吸光度(A)值,计算细胞存活率(实验组A值/对照组A值×100%)。每一样品设6个复孔,实验重复3次。

4. 细胞凋亡检测:调整细胞密度为5×105/mL,以每孔1 mL细胞悬液接种于6孔培养板,孵育过夜后药物处理同MTT实验。收集细胞,PBS洗涤3次,根据试剂盒说明书,分别加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI混匀,冰浴避光放置15 min,上流式细胞仪(Beckman Coulter EPICS XL)检测细胞凋亡。

5. 蛋白质印迹法:细胞处理同MTT实验。RIPA裂解液裂解细胞,提取细胞总蛋白,BCA法测定蛋白浓度。每一样品取20 μg总蛋白上样,行10% SDS-PAGE,转移至硝酸纤维素膜,4 ℃ 5%脱脂奶粉封闭过夜。硝酸纤维素膜经与相应一抗和二抗反应后,ECL显色、曝光、显影。ImageJ软件分析目的蛋白相对表达量。实验重复3次。

6. 细胞内ROS检测:取对数生长期细胞,以每孔5×105个接种于6孔培养板,待细胞生长至80%融合度时,药物处理同MTT实验。根据试剂盒说明书,在细胞悬液中加入10 μmol/L DCFH-DA (ROS荧光探针),置于 37 ℃、5% CO2细胞培养箱中孵育30 min,PBS洗涤、离心,上流式细胞仪(Beckman Coulter CytoFLEX)检测细胞内ROS,CytExpert软件定量分析ROS荧光强度。

三、统计学分析

结 果

一、OphA抑制体外SW480细胞增殖,并诱导细胞凋亡

光学显微镜下,OphA作用后部分SW480细胞出现皱缩,胞质中可见空泡,随着药物浓度的增加,更多细胞发生破裂(图1A)。MTT实验显示,经终浓度1、5、10 μmol/L的OphA作用24 h,SW480细胞平均存活率分别为72.3%、54.6%和42.4%,与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.01),表明OphA有显著的体外抗直肠癌细胞增殖作用,增殖抑制作用呈剂量依赖性。流式细胞分析显示,经终浓度1、5、10 μmol/L的OphA作用24 h,SW480细胞平均凋亡率分别为6.1%、14.3%和18.7%,与对照组(2.6%)相比差异均有统计学意义(P<0.001)(图1B),诱导凋亡作用亦呈明显的剂量依赖性。

二、OphA对SW480细胞凋亡相关蛋白表达和NF-κB活化的影响

蛋白质印迹法检测显示,经1、5、10 μmol/L OphA作用的SW480细胞,细胞色素C、cleaved caspase-3、IκBα表达随药物浓度增加而逐步增高,Bcl-2、p-NF-κBp65表达则随药物浓度增加而逐步降低,OphA的作用呈剂量依赖性(图2)。

A:光学显微镜下细胞形态;B:流式细胞术检测细胞凋亡

与对照组(0 μmol/L OphA)比较,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

三、OphA对SW480细胞ROS表达的影响

DCFH-DA荧光探针流式细胞检测显示,经1、5、10 μmol/L OphA作用24 h,SW480细胞内ROS表达水平逐步增高,作用呈剂量依赖性(图3)。

***与对照组(0 μmol/L OphA)比较,P<0.001

四、NAC对OphA抑制SW480细胞增殖、诱导细胞凋亡作用的影响

ROS清除剂NAC(3 mmol/L)对体外SW480细胞增殖无明显影响,但可阻断OphA(5 μmol/L)对SW480细胞的增殖抑制作用(图4)。同样,NAC对SW480细胞早期凋亡无明显影响,但可阻断OphA的诱导凋亡作用,对照组、 NAC组、OphA组和NAC+OphA组细胞凋亡率分别为2.4%、3.1%、14.9%和6.7%,OphA组与NAC+OphA组间差异有统计学意义(P<0.01)(图5)。

五、NAC对OphA调控SW480细胞凋亡相关蛋白、ROS表达和NF-κB活化作用的影响

NAC对SW480细胞凋亡相关蛋白细胞色素C、Bcl-2表达和NF-κB活化无明显影响,但可阻断OphA对上述蛋白表达的调控作用(图6)。此外,NAC不仅可下调ROS在SW480细胞中的表达,还可抑制OphA对ROS表达的上调作用(图7)。

**两组间比较,P<0.01

***两组间比较,P<0.001

讨 论

直肠癌是一种常见的消化道恶性肿瘤,近年我国直肠癌发病率呈逐年上升趋势,对人民健康造成严重威胁[6]。目前临床上使用的直肠癌化疗药物均存在较强的毒性反应,寻找低毒、高效的抗直肠癌药物成分或其前体成为当前结直肠癌治疗领域的研究热点。本研究主要观察OphA对体外人直肠癌细胞株SW480生长和凋亡的影响,并初步探讨其可能作用机制。

图5 NAC对OphA诱导凋亡作用的影响

**两组间比较,P<0.01

诱导肿瘤细胞凋亡是大多数化疗药物发挥抗癌效应的主要作用机制。本实验中,OphA可有效抑制体外SW480细胞增殖,作用呈明显的剂量依赖性,并能剂量依赖性地诱导细胞凋亡。细胞色素C作为细胞呼吸链中的一个重要组分,不仅在氧化还原和能量代谢中扮演重要角色,在线粒体启动凋亡程序中亦发挥关键的信号放大作用。其释放入细胞质后,可特异性地与caspase-9结合形成凋亡体,激活下游caspases级联反应,从而诱发细胞凋亡,而细胞色素C的释放受Bcl-2家族蛋白调节[7-9]。本研究观察到OphA可下调SW480细胞中具有抗凋亡作用的Bcl-2表达,同时检测到大量细胞色素C自线粒体中释放。Caspase-3是caspases家族凋亡执行阶段的关键酶,经OphA作用的SW480细胞中caspase-3大量激活,cleaved caspase-3表达呈OphA剂量依赖性上调,引起细胞凋亡。

ROS作为机体代谢过程中一类具有较强氧化能力的副产物,在细胞内信号转导中充当第二信使,对正常生理反应发挥重要调控作用。少量ROS可促进细胞分裂,对细胞增殖和分化具有一定促进作用;高浓度ROS则可直接或间接对细胞内DNA、脂质和蛋白质造成一定程度的破坏,从而增加线粒体膜通透性,使细胞色素C从线粒体释放至细胞质,促进细胞衰老,诱导细胞凋亡[10-12]。与正常细胞相比,高氧化应激状态多见于肿瘤细胞,同时肿瘤细胞对ROS浓度的变化更为敏感。肿瘤细胞中诸如过氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶等抗氧化剂往往表达上调,从而将ROS限定在一定浓度以维持细胞内微环境稳定。因此,通过促氧化剂上调肿瘤细胞内的ROS表达被认为是有效抑制肿瘤细胞生长、促进细胞凋亡的方式[13-14]。本实验观察到,OphA诱导SW480细胞凋亡过程中伴有ROS表达上调,当以ROS清除剂NAC清除SW480细胞内的ROS后,OphA对SW480细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用被阻断,OphA对凋亡相关蛋白表达的调控作用亦明显受抑,表明介导ROS产生和线粒体损伤在OphA诱导SW480细胞凋亡过程中发挥重要作用。

NF-κB是一种以异二聚体形式存在于细胞质中的转录因子超家族,与IκB结合时处于非活性状态,细胞内信号因子的刺激可使IκB磷酸化进而发生降解,NF-κB与IκB分离后激活,其p65亚基迅速转移至细胞核内,调节包括Bcl-2家族蛋白在内的下游靶基因转录表达,从而促进细胞存活,抑制细胞凋亡[15-16]。本研究观察显示,OphA可分别下调和上调NF-κBp65和IκBα在SW480细胞中的表达,而NAC可阻断 OphA对两者表达的调节作用,提示NF-κB信号通路可能参与了OphA通过ROS介导的诱导凋亡作用。

综上所述,本研究结果表明OphA对人直肠癌细胞的生长抑制作用依赖于ROS的产生和线粒体凋亡途径的激活,而NF-κB信号通路可能参与了ROS介导的细胞凋亡的调控。上述发现对于揭示直肠癌的发病机制以及OphA用于直肠癌的治疗有一定积极意义,ROS对NF-κB信号通路的调控作用及其确切机制尚需进一步实验加以明确。

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