林冬融，揭育东，韩江全

(1.遵义医学院第五附属(珠海)医院 神经内科，广东 珠海 519100；2.遵义医学院第五附属(珠海)医院 急诊科，广东 珠海 519100)

脑梗死是中老年人的常见病及多发病，其致残率高，严重影响患者的生活质量。细胞凋亡已被公认是脑梗死众多发病机制中的重要一环，以凋亡为主要病理变化的脑缺血半暗带面积大小决定着患者预后。而近年来众多报道均表明，细胞凋亡亦是糖尿病加重脑缺血再灌注损伤的重要机制之一[1-2]。尤瑞克林是我国科研工作者研发的一种治疗急性缺血性脑血管病药物，它可以选择性扩张缺血区脑血管、减轻神经细胞损伤、抑制神经细胞凋亡、促进内源性神经再生[3]。本实验通过模拟糖尿病大鼠脑缺血再灌注损伤的病理生理过程，探讨尤瑞克林对糖尿病合并急性脑缺血再灌注损伤神经细胞的保护机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 健康雄性SD大鼠82只，8周龄，体重250～300 g，广东省医学实验动物中心提供。所有大鼠随机分为3大组：(1)尤瑞克林治疗组(简称尤瑞克林组)：36只；(2)缺血组：36只；(3)假手术组：10只。前两组再随机分为脑缺血2 h再灌注12 h、24 h、48 h三个亚组，每个亚组12只动物。

1.2 药物与试剂 链脲佐菌素(Sigma公司)、Cyt-C Rabbit mAb及caspase-3 Rabbit mAb(武汉博士德生物工程有限公司)、S-P超敏试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司)、DAB显色试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司)、TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)、注射用尤瑞克林(广东天普生化医药股份有限公司)。

1.3 实验仪器 微机血糖仪(美国雅培公司)、MiVnT 显微生物图像分析系统(广东珠海微宇公司)、XMTB数显温控仪(浙制02810215)、培养/干燥箱PH030A(上海一恒科技有限公司)、Leica DM LB2光学显微镜(德国)。

1.4 方法

1.4.1 糖尿病模型制作 所有SD大鼠均在实验前8 h禁食，6 h禁水。在术前30 min新鲜配制浓度为5 mg/mL的无菌链脲佐菌素(STZ)。常规消毒后，以2 mg/100 g在大鼠左下腹腔注射STZ，于24 h以3.5 mg/100 g再次注射STZ。术后自由进水进食。7 d后以微机血糖仪测定大鼠尾尖外周血血糖，选取非空腹血糖16.7～25.6 mmol/L的大鼠作为本次实验糖尿病大鼠模型。

1.4.2 MCAO/R大鼠模型 参照Zea-longa法[4]制作。将实验大鼠固定，于右侧颈部作一纵向切口，分离颈总动脉(上至同侧颈外动脉)，结扎颈总动脉近心端，并于颈总动脉与颈外动脉分叉处结扎颈外动脉。于颈总动脉近心端结扎处放一丝线，暂不收紧，在丝线与结扎处之间的血管壁作一切口，插入一线身直径0.26 mm，线头直径0.36 mm的成品栓线至颈内动脉，有阻力感后停止，收紧预置丝线以固定后消毒及逐层缝合。假手术组按上述步骤切开及分离颈总动脉、颈外动脉后重新缝合皮肤，不切开血管插入栓线。术后2 h，将手术缝合口处栓线外露残端抽出至有阻力感，说明栓线头端已退回至颈总动脉。尤瑞克林组用灭菌0.9%氯化钠溶液稀释为8.75×10-3PNA 单位/kg，给药量1 mL/kg，于再灌后30 min经舌下静脉给药。缺血组于同样时间给予等量生理盐水。假手术组不注射。将大鼠放入鼠笼中饲养，自由饮食，室温保持在25 ℃，按相应的时间点(12、24、48 h)处死动物，断头取脑，固定、脱水、透明、包埋。

1.4.3 神经功能评分 分别于再灌注12、24、48 h各个时间点处死动物前进行神经功能评分：评分标准按照Bederson[5]6级5分制。0分：无神经功能缺损，1分：对侧上肢不能完全伸展，2分：对侧肢体抵抗力下降，3分：提尾时向对侧转圈，4分：行走时自动转圈，5分：对刺激无反应，无自发性活动。评分为2分及2分以上表示模型成功，分数越高，则神经功能缺损越严重。

1.4.4 凋亡细胞数检测 采用原位缺口末端标记法(TUNEL法)检测细胞凋亡数目，严格按照细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作。细胞核有凋亡形态学特征并有棕黄色颗粒者为阳性凋亡细胞。随机选取缺血半暗带区内5个不相重复的视野，计算阳性凋亡细胞数目，取其平均值用于各组间统计学比较。

1.4.5 Cyt-C及caspase-3表达检测 免疫组织化学采用S-P法。具体操作严格按照免疫组化检测试剂盒(S-P法)说明书进行，Ⅰ抗分别为Cyt-C Rabbit mAb及caspase-3 Rabbit mAb。细胞胞浆呈棕黄色者为阳性细胞。以MiVnT显微生物图像分析系统对图片进行分析，平均灰度级表示图像的透光率，平均灰度级数值越低，说明图片透光率越低，染色越深，阳性率越高。取平均灰度级的算术均数用于各组间统计学比较。

2 结果

2.1 造模前大鼠尾尖外周血血糖测定 造模前假手术组血糖值(21.11±1.70) mmol/L，缺血组血糖值为(21.09±2.67)mmol/L，尤瑞克林组血糖值为(20.72±2.78)，三组间血糖值比较差异无统计学意义。

2.2 神经功能评分 假手术组大鼠神经功能评分均为0分，未见神经功能缺损，其余两组大鼠出现不同程度的神经功能缺损表现，与假手术组相比差异显著(P<0.01)。其中，缺血组及尤瑞克林组的神经评分表现为随时间的延长逐渐增高，24 h达到最高；尤瑞克林组的神经评分均低于相同时点缺血组(P<0.05，见表1)。

表1 各组神经功能评分比较

2.3 凋亡细胞计数 假手术组可见少量凋亡细胞，其余两组大鼠缺血半暗带中均可见大量凋亡细胞，与假手术组相比差异显著(P<0.01)。缺血组和尤瑞克林组的细胞凋亡数随时间的延长逐渐增高，24 h达到最高；尤瑞克林组的凋亡细胞数均低于相同时点缺血组(P<0.05)，见表2，图1。

表2 各组凋亡细胞计数比较

A:假手术组;B:缺血组12 h;C:缺血组24 h;D:缺血组48 h;E:尤瑞克林组12 h;F:尤瑞克林组24 h;G:尤瑞克林组48 h；细胞核内有棕黄色颗粒为TUNEL染色阳性细胞，细胞胞核呈蓝色为正常细胞。

2.4 免疫组化检测Cyt-C及caspase-3表达 假手术组Cyt-C及caspase-3表达极低，缺血组及尤瑞克林组Cyt-C及caspase-3表达随再灌注时间延长逐渐增加，于24 h达高峰，Cyt-C表达强度随后逐渐降低，而caspase-3于48 h后表达仍处于高水平，无明显下降，该两组平均灰度级与假手术组相比，存在显著差异(P<0.01)。其中，尤瑞克林组的Cyt-C及caspase-3表达水平均显著低于相同时间点缺血组，有统计学差异(P<0.05)，见表3图2和表4图3。

表3 Cyt-C免疫组化灰度级比较

A:假手术组;B:缺血组12 h;C:缺血组24 h;D:缺血组48 h;E:尤瑞克林组12 h;F:尤瑞克林组24 h;G:尤瑞克林组48 h；细胞浆染成棕黄色者为阳性细胞；细胞结构较为完整，胞核呈蓝色者为正常细胞。

表4 Caspase-3免疫组化灰度级比较

A:假手术组;B:缺血组12 h;C:缺血组24 h;D:缺血组48 h;E:尤瑞克林组12 h;F:尤瑞克林组24 h;G:尤瑞克林组48 h；细胞浆染成棕黄色者为阳性细胞；细胞结构较为完整，胞核呈蓝色者为正常细胞。

3 讨论

随着人类生活水平提高，糖尿病已成为中老年患者的常见慢性病，同时，糖尿病也是缺血性脑血管病的独立危险因素，患者的血糖越高，发生急性脑梗死后脑损伤的程度越重，预后更差[6]。国内外相关研究证实[1-2]，细胞凋亡在高血糖加重脑缺血再灌注损伤的众多机制中起着至关重要的作用，而线粒体途径则是3条经典的细胞凋亡途径之一[7-8]。研究认为[9]，线粒体作为为机体提供直接能量来源的细胞器，在细胞凋亡过程中亦扮演着重要角色。Cyt-C是一种由核基因编码的水溶性蛋白，而caspase-3则是一组具有相似的氨基酸顺序、二级结构的半胱氨酸蛋白酶，二者均系线粒体内重要的凋亡相关性因子，参与调节线粒体的代谢[10-11]。急性脑缺血再灌注发生后，在各种病理因素的刺激下，线粒体内膜上的非特异性通透性转运孔(the permeability transition pore，PTP)的通透性增加并开放[12]，促使Cyt-C从线粒体内通过PTP释放入胞浆，与生理条件下无活性的caspase-9的前体相结合，使caspase-9活化，后者可进一步激活下游的caspase-3，引发caspase级联反应，导致细胞凋亡，因此，Cyt-C是细胞凋亡扳机点，而caspase-3则是下游的执行者[13-14]。新近研究发现，细胞色素C1亚基2和NDUFS2可能与心肌缺血再灌注损伤有关[15]。在本课题组前期有关糖尿病加重脑缺血再灌注损伤的细胞凋亡途径研究中，通过对比正常血糖组及高血糖组大鼠脑缺血再灌注后Cyt-C表达的变化发现，对比正常血糖组，高血糖组大鼠脑缺血半暗带中Cyt-C及caspase-3的表达显著增强，提示高血糖可加重脑缺血再灌注后脑神经细胞的凋亡，而Cyt-C及caspase-3的激活及表达增强可能是糖尿病加重脑缺血再灌注损伤的机制之一[16]。

尤瑞克林即人尿激肽原酶，是我国科研工作者研发的一种治疗急性缺血性脑血管病药物，是从人类尿液中提取的丝氨酸蛋白酶，能催化激肽原水解产生激肽，后者及其进一步降解产物能与缺血部位血管内皮细胞产生的 B1 受体结合发挥扩张微动脉的作用。因B1受体仅在组织受缺血损伤后由损伤的组织血管内皮细胞诱导生成，故尤瑞克林可选择性地扩张缺血区脑血管，从而提高缺血脑组织血流量，改善脑组织对氧的摄取[17-20]。近年来多项研究显示，尤瑞克林的脑保护作用与多个凋亡相关因子有着密切关系，可通过上调Bcl-2表达，下调Caspase-3、Fas-L蛋白、Bax蛋白表达，抑制p38MAPK活化等，从而抑制神经细胞凋亡，促进内源性神经再生[21-24]，改善神经功能缺损症状[25]。经《中国急性缺血性脑卒中诊治指南(2010年版)》推荐用于缺血性脑血管病急性期治疗[26]。同时，在临床疗效观察中，对急性脑梗死合并2型糖尿病患者采用美国国立卫生研究院脑卒中量表(NIHSS评分)、改良RankinScale(mRS评分)及日常生活能力量表(ADL评分)评定尤瑞克林治疗组和对照组两组患者疗效，证明尤瑞克林治疗2型糖尿病并发急性脑梗死疗效显著[27-28]，但其保护机制尚未明确。

在本实验的糖尿病大鼠中，缺血组及尤瑞克林组的神经功能评分表现为随时间的延长逐渐增高，24 h达到最高，且尤瑞克林组在各个时点的评分低于缺血组(P<0.05)，说明尤瑞克林对糖尿病大鼠脑缺血再灌注后的神经功能缺损具有保护作用，与上述尤瑞克林治疗2型糖尿病并发急性脑梗死临床疗效观察结果相一致。凋亡细胞计数结果亦提示缺血组和尤瑞克林组的细胞凋亡数随时间的延长逐渐增高，24 h达到最高，尤瑞克林组各个时点的凋亡细胞数明显低于缺血组(P<0.05)，说明尤瑞克林对糖尿病大鼠脑缺血再灌注损伤的保护机制可能是通过抑制缺血半暗带中的神经细胞凋亡实现。本研究还通过免疫组化检测Cyt-C及caspase-3表达发现，缺血组及尤瑞克林组Cyt-C及caspase-3表达随再灌注时间延长逐渐增加，于24 h 达高峰，随后逐渐降低，而caspase-3于48 h后表达仍处于高水平，无明显下降，与脑缺血后半暗带区Cyt-C及caspase-3表达时相变化的研究相一致[29-31]，而尤瑞克林组各个时间点的Cyt-C及caspase-3表达水平均显著低于缺血组(P<0.05)。结合上述研究结果，我们得出如下结论：尤瑞克林对糖尿病大鼠局灶性脑缺血再灌注后神经细胞凋亡的抑制作用可能是通过下调Cyt-C及caspase-3表达实现。