简晓莉，刘志承，李曙光，张尚斌，陈香铃

(深圳市中医院，深圳 518033)

白癜风是一种皮肤或黏膜色素减退或脱失的常见疾病，临床主要表现为皮肤或黏膜一片或数片白斑，初起边界不清，后逐渐增多、扩大，甚至蔓延至全身，病程较长，迁延难愈，很少有自行消退者。目前白癜风的发病原因尚不清楚，中医认为白癜风属“白驳风”范畴，又有“白癜”、“白处”、“白毋奏”等中医病名[1]。一般认为内因主要为七情内伤、肝气郁结、久病耗气或气滞血瘀、精亏血少、肝肾不足，内外相因，终至气血失和、血不养肤而发为本病[2]。本院在长期的临床实践中发现，复方补骨脂酊在治疗白癜风疾病中具有很好的效果，临床上常用于治疗白癜风及各种白斑、斑秃、脱发。但应用过程中存在携带及使用不便、容易污染衣物等问题，限制了该药在临床上的广泛应用。因此拟将复方补骨脂酊进行剂型改革，本研究通过正交试验，优选复方补骨脂酊的最佳提取工艺，为其剂型改革提供研究资料。

1 仪器与试药

1.1 仪器 LC-20AT高效液相色谱仪(CTO-10AS vp 柱温箱、LCsolution 工作站)，日本岛津公司; Agilent TC- C18色谱柱(250 mm×4．6 mm，5 μm); AUW220D型电子天平 (十万分之一)，日本岛津公司；0.45 μm 微孔滤膜(PTFE)，Thermo；电热恒温干燥箱(GZX-DH.500-BS -Ⅱ)，上海跃进医疗器械厂。

1.2 试药 补骨脂素、异补骨脂素对照品(批号分别为110739-201416和110738-201313，中国药品生物制品检定研究院);乙腈(色谱纯，德国默克公司)；甲醇为分析纯，乙醇为药用级别，水为超纯水; 补骨脂(批号180225)、白芷(批号171231)、红花(批号180306)、丹参(批号171117)饮片经深圳市中医院药检室刘纪青主任中药师鉴定，均符合2015年版《中国药典》(一部)有关规定，均由毫州市永刚饮片厂有限公司提供。

2 方法与结果

2.1 补骨脂素和异补骨脂素含量的测定

2.1.1 色谱条件 Agilent TC- C18色谱柱(250 mm×4．6 mm，5 μm)，流动相为乙腈-水，梯度洗脱：0～35 min，甲醇为 22%→40%；流速: 1 ml/min，检测波长246 nm，柱温: 35 ℃，进样体积10 μl。

2.1.2 溶液制备

2.1.2.1 对照品溶液的制备 精密称取补骨脂素和异补骨脂素对照品适量，加甲醇配制成浓度为 0．212和0．213 mg/ml的对照品混合溶液。

2.1.2.2 供试品溶液的制备 补骨脂、白芷、红花、丹参各15 g，加乙醇浸渍，滤过，加乙醇定容至500 ml，为复方补骨脂酊储备液。精密量取储备药液1 ml，置5 ml量瓶中，加乙醇定容至刻度，制成供试品溶液，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.1.2.3 阴性样品溶液的制备 按复方补骨脂酊的处方去除补骨脂后其余味药，按复方补骨脂酊制备方法，制备缺补骨脂阴性对照品，按供试品溶液制备方法制得阴性对照品溶液。

2.1.3 系统适用性试验 精密量取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10 μl注入液相色谱仪，记录色谱图。补骨脂素与异补骨脂素峰分离良好，阴性样品无干扰。见图1。

1.补骨脂素 2.异补骨脂素

2.1.4 线性关系考查 分别吸取补骨脂素和异补骨脂素混合对照品溶液(浓度为0．212和0．213 mg/ml)0.125、0.25、0.375、0.5、0.625、0.75和1.25 ml，分别置于10 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，制成补骨脂素浓度分别为2.650、5.300、7.950、10.600、13.250、15.900和26.500 μg/ml,异补骨脂素浓度分别为2.663、5.325、7.988、10.650、13.313、15.975和26.625 μg/ml的对照品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件测定补骨脂素和异补骨脂素峰面积，以进样量的自然对数为横坐标(X)，以峰面积积分值自然对数为纵坐标(Y)，得补骨脂素回归方程Y=84 390X+17 112(R2=0．999 6)，异补骨脂素回归方程Y=82 172X+13 558(R2=0．999 8)，结果表明补骨脂素在2．650～26．500 μg 范围内与峰面积呈良好线性关系，异补骨脂素在2．663～26．625 μg 范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.1.5 精密度试验 取补骨脂素和异补骨脂素对照品溶液连续进样6次，每次10 μl，测定峰面积，RSD分别为1.04%和1.95%。

2.1.6 稳定性试验 按“2.1.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件，分别在第 0、2、4、8、12和24 h 进样，测补骨脂素和异补骨脂素峰面积，RSD分别为1.58%和1.23%。

2.1.7 重复性试验 取同一复方补骨脂酊储备液6 份，分别按“2.1.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样，测定补骨脂素和异补骨脂素含量。结果储备药液中补骨脂素和异补骨脂素平均含量分别为3．775和3．209 mg/ml，RSD分别为1.82%和1.24%。

2.1.8 加样回收率试验 取已知含量的储备药液(补骨脂素和异补骨脂素平均含量分别为3．775和3．209 mg/ml) ，共取 9 份，每份0.5 ml，分别加补骨脂素和异补骨脂素对照品溶液 (浓度分别为1.892和1.624 mg/ml)0.5、1.0和1.5 ml各3份，按“2.1.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件测定峰面积，结果补骨脂素和异补骨脂素平均回收率分别为98.90%和97.42%，RSD分别为1.42%和1.65%，结果见表 1和表2。

表1 补骨脂素加样回收率试验结果(n=9)

表2 异补骨脂素加样回收率试验结果(n=9)

2．1．9 含量测定 精密量取储备药液1 ml，按“2.1.2.2”项下方法制备供试品，按“2．1．1”项下色谱条件进样，测定药液中补骨脂素和异补骨脂素的含量。

2.2 总固物 精密量取复方补骨脂酊储备液25 ml，置干燥至恒重的蒸发皿，水浴蒸干，于 105 ℃ 干燥3 h，称重，计算总固物量[3]。

2.3 正交试验

2.3.1 正交试验及结果 以乙醇浓度、乙醇用量及浸渍时间为因素进行正交试验，每个因素设 3 个水平，设置乙醇浓度为60%、70%和80%，乙醇用量为3、5和7倍，浸渍时间为7、10和14 d。选用 L9(34) 正交表。试验安排及结果见表3-5。

表3 正式试验因素水平

表4 正交试验及结果

注：综合评分值= 补骨脂素和异补骨脂素总含量 /补骨脂素和异补骨脂素总含量最大值 ×100×0．6+总固物/总固物最大值×100×0.4。

表5 方差分析

注:F0．05( 1，2) = 19，F0．01( 1，2) = 99。

极差(R值) B>A>C，直观分析表明: 各因素对提取效果的影响为乙醇用量>乙醇浓度>浸渍时间，最佳参数为 B3A1C2；方差分析结果表明：A、B、C因素均为非显著因素，从节省时间、提高效率角度出发，确定提取工艺为B3A1C1，即7倍量的60%乙醇浸渍7 d。

2.3.2 验证试验 取处方量药材 6 份，按B3A1C1提取工艺，即7倍量的60%乙醇浸渍7 d，滤过，定容至 500 ml，按“2.1.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件，测定补骨脂素和异补骨脂素含量，按“2.2”项下方法测得总固物，结果见表 5，补骨脂素和异补骨脂素平均含量分别为9.841和8.083 mg/ml，总固物平均为0.630 6 g。结果表明按B3A1C1提取工艺，补骨脂素和异补骨脂素含量和总固物接近最大值，说明工艺合理可行。

表6 验证试验结果

3 讨论

复方补骨脂酊由补骨脂、丹参、白芷、红花组成，采用乙醇浸渍法制备。该方以补骨脂为君药，温肾助阳，外用消斑祛风；臣药以丹参活血化瘀；白芷、红花均为佐药，白芷活血生肌、红花活血养血，具有温通气血、调和营卫之功效，主要用于治疗白癜风及各种白斑、斑秃、脱发。白癜风发病机制目前仍不清楚，中医方法对白癜风患者进行治疗具有一定的优势，并且在临床上的经验也更加丰富[4]。研究发现单味中药女贞子、丹参、白芷、菟丝子、补骨脂、红花可促进黑素细胞黏附，刺蒺藜、女贞子、黄芪、白芷、补骨脂对黑素细胞迁移有诱导作用[5]。在外用中药制剂中，单用或以补骨脂为主药进行组方治疗白癜风的报道较多[6-10]，故本研究选用补骨脂素和异补骨脂素含量作为主要指标，综合评分权重定为60%。总固物中其他成分对本方功效共同发挥作用，故设定总固物权重为40%。

复方补骨脂酊原生产工艺为补骨脂150 g、丹参150 g、白芷150 g、红花150 g ，采用乙醇浸渍法制备，浸渍7 d后过滤，加乙醇至1 000 ml，乙醇用量仅为药材量的1.67倍，提取效果不佳，在设置因素水平时，参考文献[11-13]，将乙醇用量设为3、5、7倍三个水平，试验结果直观分析表明：各因素对提取效果的影响为乙醇用量>乙醇浓度>浸渍时间，说明加大乙醇用量对提取效果具有较大影响。本研究通过对补骨脂素和异补骨脂素的含量指标及总固物指标进行综合评价，采用 L9(34)正交试验法优化复方补骨脂酊提取工艺，对其提取工艺进行筛选，保证制剂质量。最终优选出最佳提取工艺为加7倍量的60%乙醇浸渍7 d，通过验证试验证明该工艺稳定可行，为复方补骨脂酊剂型改革的研制和生产提供了参考。