李美芳，刘 敏，李玉兰，李筱玲，王铁杰

(深圳市药品检验研究院,深圳药品质量标准研究重点实验室，深圳 518057)

盐酸伊托必利为第四代胃动力药[1]，国内制剂分别有片剂、胶囊剂和分散片剂。该品种为本院承担的国家药典委员会2010—2011年标准提高行动计划研究课题和2012年国家药品评价性抽验品种。其制剂质量标准共9个，均为注册标准或新药转正标准，其中8个标准、3种剂型的含量测定方法均采用紫外分光光度法(UV法)。通过实验研究，发现UV法使用的定性滤纸对含量测定结果影响很大，在溶液稀释过程中溶液在移液管中特别容易挂壁，故建立测定盐酸伊托必利片、分散片和胶囊的含量测定HPLC法，采用一步稀释、0.45 μm滤膜滤过后直接进样，省却了稀释步骤，既提高工作效率又避免误差的产生。本文建立的含量测定方法收载于《中国药典》2015年版二部[2]。BP(2018)、EP(9.2)、USP(40)、JP(XVII)均未收载该品种。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Alliance 2695-996液相色谱仪(美国沃特世公司)，UltiMate 3000液相色谱仪(德国戴安公司)，Alltima C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，Kromasil 100-5 C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，XS205DU十万分之一型电子天平(瑞士梅特勒公司)。

1.2 试药 国内3种剂型、9家生产企业(分别依次为A～I)共27批次样品；盐酸伊托必利对照品(中国食品药品检定研究院，批号100939-200701，含量：99.9%)；盐酸伊托必利原料(生产企业E，批号100801，含量为100.1%)；乙腈为色谱纯，Merk公司产品；磷酸二氢钾为分析纯；水为millipore超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Alltima C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，流动相为0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液(pH 4.0)-乙腈(80∶20)，流速：1 ml/min，检测波长：258 nm，柱温：30 ℃，进样量： 20 μl。理论板数按伊托必利峰计算不低于5 000，伊托必利峰与其他相邻杂质峰的分离度符合要求。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 取盐酸伊托必利对照品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1 ml中约含0.1 mg的溶液。

2.2.2 供试品溶液 取样品20片(粒)，精密称定，研细或取内容物混匀，精密称取适量(约相当于盐酸伊托必利50 mg)，置500 ml量瓶中，加水适量，超声使盐酸伊托必利溶解，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.3 专属性试验 按相应处方分别配制9家生产企业的空白混合辅料溶液。分别精密量取对照品溶液、供试品溶液、空白辅料溶液和空白溶剂，按“2.1”项下色谱条件测定，空白辅料、空白溶剂对主峰均无干扰。见图1。

2.4 线性范围 精密称取对照品约50 mg，置50 ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀(1 mg/ml)，分别精密量取适量，稀释制成盐酸伊托必利的浓度为0.01、0.05、0.1、0.2、0.5和1.0 mg/ml的溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图，以浓度C(mg/ml)对峰面积A进行线性回归，得线性方程A=3.907×107C-9.90×104(r=0.999 9，n=6)。结果表明，盐酸伊托必利的浓度在0.01～1 mg/ml范围内与峰面积线性关系良好。

2.5 溶液稳定性试验 选取样品(批号为E10)进行考查。结果显示，供试品溶液在常温下放置1、2、4、6、10和16 h后分别进样，供试品主峰面积无变化(RSD为0.06%)，说明溶液在16 h内稳定。

2.6 重复性试验 分别取片剂(批号为C10)、分散片剂(批号为I14)、胶囊剂(批号为G4)各1批，配成3个浓度水平(相当于标示含量的80%、100%和120%)，每个浓度3份，按“2.1”项下色谱条件进样测定，片剂平均含量为100.3%，RSD为0.4%；分散片剂平均含量为101.1%，RSD为0.6%；胶囊剂平均含量为109.6%，RSD为0.5%。

1.盐酸伊托必利

2.7 加样回收率试验 取盐酸伊托必利对照品约10 mg，精密称定，置100 ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；另取盐酸伊托必利原料(含量为100.1%)约1.25 g，精密称定，置500 ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液；取供试品(片剂，批号为D21，含量105.8%；胶囊剂，批号G4，含量109.4%；分散片，批号I14，含量101.2%)细粉适量(约相当于盐酸伊托必利25 mg)，精密称定，每种制剂取9份(共27份)，分别置500 ml量瓶中，分别精密量取对照品储备溶液6、10和15 ml各3份于上述量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为回收率测定供试品溶液；取上述溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，测得片剂平均回收率为101.8%，RSD为0.93%(n=9)；胶囊剂平均回收率为101.1%，RSD为0.68%(n=9)；分散片剂平均回收率为101.6%，RSD为0.85%(n=9)。见表1。

表1 加样回收率试验结果(n=9)

2.8 日间精密度 取片剂(批号C10)的供试品，在不同日分别按“2.1”项下色谱条件进样测定，两次的含量测定结果分别为100.7%和100.3%，表明日间精密度良好。 取分散片(批号I14)的供试品，在不同日分别按“2.1”项下色谱条件进样测定，两次的含量测定结果分别为99.6%和101.2%，表明日间精密度良好。 取胶囊(批号G4)的供试品，在不同日分别按“2.1”项下色谱条件进样测定，两次的含量测定结果分别为108.5%和109.4%，表明日间精密度良好。

2.9 耐用性试验 选用2根不同品牌和规格的C18柱测定每个厂家1批样品，共5批片剂、1批分散片、3批胶囊的含量。结果显示，2根色谱柱测定结果基本一致，说明方法耐用性良好。

2.10 检出限和定量限 以信噪比为3∶1，测得系统的最低检测浓度为0.3 μg/ml，即最低检测限为6 ng。以信噪比为10∶1，测得最低定量浓度为1.0 μg/ml，即最低定量限为20 ng。

2.11 样品含量测定 取盐酸依托必利制剂共27批，分别按 “2.2.1”和“2.2.2”项下制备对照品溶液和供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积，按外标法计算盐酸伊托必利的含量，结果见表2。

表2 含量测定结果(n=2)

3 讨论

国内9家生产企业，其中生产企业A采用二步稀释，定性滤纸滤过后再用滤膜滤过，HPLC法测定；其余8家生产企业采用二步稀释，定性滤纸滤过，UV法测定盐酸伊托必利的含量。UV法采用的检测浓度为10 μg/ml，新建的HPLC法采用的检测浓度为0.1 mg/ml，因此在这9家生产企业各选取1批样品，使用HPLC法的供试品溶液滤纸滤过后稀释10倍作为UV法的供试品溶液，结果发现采用滤纸过滤之后的含量测定结果低于不用定性滤纸过滤的含量测定结果，部分企业产品结果差值较大。见表3。

表3 不同方法的含量测定结果(n=2)

备注： *- HPLC： 50 mg→50 ml，滤纸过滤，取续滤液5 ml→50 ml，0.45 μm滤膜过滤，取续滤液； *- UV ： 50 mg→50ml，滤纸过滤，取续滤液5 ml→50 ml，再取5 ml→50 ml； △ HPLC： 50 mg→500 ml，0.45 μm滤膜过滤，取续滤液

与结果差距最大的生产企业D联系，确认未用滤纸过滤的HPLC含量测定结果是否符合实际生产的投料量。经企业反馈，确实存在根据中间体的含量测定结果而调整片重的情况，根据所询问批次的片重记录和理论片重的比较，认为未用滤纸过滤的HPLC含量测定结果是符合生产实际的。

另外在试验过程中发现盐酸伊托必利水溶剂的对照品溶液和供试品溶液在移液管中特别容易挂壁，如果有稀释步骤，移液过程必须控制放液速度非常缓慢，否则影响试验精度与准确度。

本文采用样品直接稀释到500 ml，0.45 μm滤膜滤过，HPLC法测定，省却了稀释步骤，既提高工作效率又避免误差的产生，使测定结果能反映产品的真实含量，优于多步稀释的UV法，并能同时测定盐酸伊托必利三种制剂的含量，操作简便快捷，可用于盐酸伊托必利的质量控制。