吴勇亮 苗鹏飞 于辉 谭淑雯 杨虹 彭钟琴 杨映

摘要：【目的】明确鳜鱼发病死亡的原因，并进行病原菌分离鉴定及药敏特性分析，为生产养殖中有效防治迟缓爱德华菌病提供参考依据。【方法】从患病鳜鱼肝脏中分离优势菌株，采用回归感染试验确定其致病性，通过细菌生理生化及16S rDNA序列分析对菌株进行鉴定，并以K-B纸片扩散法进行药物敏感性检测。【结果】分离出的菌株FS170808具有一定致病力，可使健康鳜鱼发病死亡，其半致死剂量为9.5×105 CFU/mL；菌株FS170808经生理生化和16S rDNA序列分析鉴定均为迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda），其对氨苄西林、头孢曲松、头孢呋辛、庆大霉素、卡那霉素、氧氟沙星、四环素和多西环素等17种药物高度敏感，对头孢氨苄、头孢拉定、头孢他啶、新霉素和多粘菌素B中度敏感，对苯唑西林、复方新诺明、麦迪霉素和万古霉素已产生耐药性。【结论】迟缓爱德华氏菌可引起鳜鱼发病死亡，生产养殖中可选用氨苄西林、头孢曲松、头孢呋辛和庆大霉素等高度敏感性药物进行防治。

关键词： 鳜鱼；迟缓爱德华氏菌；分离鉴定；16S rDNA；药敏试验

中图分类号： S965.199 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）04-0794-06

Isolation，identification and drug susceptibility test of pathogenic Edwardsiella tarda in Siniperca chuatsi

WU Yong-liang， MIAO Peng-fei， YU Hui， TAN Shu-wen， YANG Hong，

PENG Zhong-qin， YANG Ying*

（College of Life Science and Engineering， Foshan University， Foshan， Guangdong 528225， China）

Abstract：【Objective】Death causes of Siniperca chuatsi were studied， isolation and identification of pathogenic bacteria and analysis of drug susceptibility were conducted to provide reference for effective prevention and treatment to Edwardsiella tarda disease in aquaculture. 【Method】Dominant strain was isolated from liver tissue of ill S. chuatsi. Pathogenicity of the strain was determined by recursive infection experiment. The strain was identified by using bacteria physiological and biochemical analysis and 16S rDNA sequence analysis. K-B paper disk diffusion was applied to test its drug susceptibility. 【Result】Isolated strain FS170808 had certain pathogenicity and could lead to morbidity and death of healthy S. chuatsi. Its median lethal dose was 9.5×105 CFU/mL. The strain FS170808 was identified as E. tarda through physiological and biochemical identification and 16S rDNA sequence analysis. The strain was highly susceptible to 17 kinds of drugs including ampicillin， cefatriaxone， cefuroxime， gentamicin， kanamycin， ofloxacin， tetracycline， doxycycline and the others， intermediately susceptible to cephalexin， cefradine， ceftazidine， neomycin， polymyxin B， and resistant to oxacillin， selectrin， aboren， and vancomycin. 【Conclusion】E. tarda can lead to the morbidity and death of S. chuatsi. The highly susceptible drugs such as ampicillin， cefatriaxone， cefuroxime and gentamicin can be used for prevention and treatment in aquaculture.

Key words： Siniperca chuatsi； Edwarsdsiella tarda； isolation and identification； 16S rDNA； drug susceptibility test

0 引言

【研究意義】迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）为肠杆菌科爱德华菌属的革兰氏阴性短杆菌，广泛存在于溪水、湖泊和海洋等水环境中，能感染鱼类、两栖类、爬行类、鸟类甚至哺乳类动物（Wang et al.，2014；Su et al.，2015），因具有兼性胞内寄生特性，成为人—鱼—兽共患病的条件致病菌。近年来，迟缓爱德华氏菌对鱼类健康的危害越来越凸显（Xu and Zhang，2014），可使鱼类腹部积水肿胀、体表出血、肠内出现黏液等，并造成大量死亡。因此，加快迟缓爱德华氏菌的鉴定及药物敏感性检测，对水产养殖业的持续健康发展具有重要意义。【前人研究进展】迟缓爱德华氏菌、鮰爱德华氏菌（E. ictaluri）和保科爱德华氏菌（E. hoshinae）均为爱德华氏菌属细菌，其中迟缓爱德华氏菌的寄主范围最广，可感染多种鱼类（Leung et al.，2012）。陈言峰等（2017）采用16S rDNA基因测序、进化树构建和细菌生化管检测等方法对鲮鱼源致病菌进行鉴定，并采用K-B纸片扩散法进行药敏试验，结果发现分离获得的致病菌株为迟缓爱德华氏菌；程俊茗等（2017）采用管家基因测序、进化树构建和菌株生理生化检测等方法对分离的鲫源菌株进行鉴定，结果发现分离菌株为迟缓爱德华氏菌。此外，研究者们在斑马鱼（Barchydanio rerio var）（Wang et al.，2014）、斑点叉尾鮰（Ictnlurus punctatus）、鲤鱼（Cyprinus carpio）、日本鳗鲡（Anguilla japonica）、尼罗罗非鱼（Oreochromis nilo-tica）、漠斑牙鲆（Paralichthys lethostigmo）（孙莉娜，2016）、大菱鲆（Scophthalmus maximus）（Huo et al.，2017）中也发现有迟缓爱德华氏菌感染。【本研究切入点】鳜鱼（Siniperca chuatsi）因肉嫩味美、营养丰富而广受消费者喜爱，市场需求量大，经济前景良好。随着鳜鱼养殖密度不断提高、病害逐年增加，对鳜鱼的病害防治技术研究越显急迫（黄嘉荣，2016），但至今未见鳜鱼感染迟缓爱德华氏菌的相关研究报道。【拟解决的关键问题】通过对患病鳜鱼的肝脏进行病原菌分离鉴定及药敏试验，确定鳜鱼发病原因并提供用药指导，为水产养殖生产中防治迟缓爱德华菌病提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

鳜鱼病样采自广东佛山市南海区某养殖场，体重240～260 g/尾。健康鳜鱼（248±18 g/尾）取自佛山市南海百容水产良种有限公司。营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、SS琼脂培养基和细菌微量生化鉴定管均购自广东环凯微生物科技有限公司，细菌基因组DNA提取试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司，抗生素纸片购自杭州滨和微生物试剂有限公司。

1. 2 病原菌分离与纯化

在无菌状态下，从患病濒死鳜鱼的肝脏、肾脏和脾脏中取样，划线接种于营养琼脂培养基上，28 ℃培养48 h后从肝脏中分离出优势菌落并进行纯培养，接种于营养肉汤培养基，命名为FS170808；28 ℃培养24 h后，加入无菌甘油，置于-80 ℃冰箱保存备用。

1. 3 人工感染试验

健康鳜鱼暂养1周，水温控制在28 ℃，连续充气增氧，无异常情况后进行人工感染试验。70尾健康鳜鱼分为7组（6组为试验组，1组为对照组），每组10尾。将菌株FS170808稀释成1.5×108、1.5×107、1.5×106、1.5×105、1.5×104和1.5×103 CFU/mL 6个浓度，每个浓度按0.3 mL/尾的剂量对鳜鱼进行腹腔注射；对照组鳜鱼则按相同剂量在相同部位注射生理盐水。连续观察15 d，每天正常喂养、充氧、吸污换水，同时观察记录发病症状及死亡情况，对患病鳜鱼进行病原菌分离鉴定，并根据寇氏法（李翠萍等，2012）计算半致死剂量。

1. 4 病原菌生理生化鉴定

对菌株FS170808进行革兰氏染色后在光学显微镜下观察；同时接种于营养琼脂培养基和SS琼脂培养基中，28 ℃下培养24 h，观察菌落形态特征。将菌株FS170808接种于营养肉汤培养基中，培养18 h后分别取80.0 μL菌液加入到葡萄糖（产酸产气）、葡萄糖磷酸盐胨水（V-P）、葡萄糖磷酸盐胨水（M.R.）、蔗糖、甘露醇、乳糖、赖氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、西蒙氏柠檬酸盐、硫化氢、尿素和麦芽糖的微量生化鉴定管中，37 ℃培养12～48 h后判定结果。

1. 5 病原菌16S rDNA基因序列鉴定及发育树构建

菌株FS170808接种于营养肉汤进行培养基培养、DNA提取、16S rDNA序列PCR扩增、PCR产物测序等试验操作步骤均参照冯艺等（2017）的方法。将测序得到菌株FS170808的16S rDNA序列在NCBI数据库上（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）进行BLAST比对，同时利用MEGA 4.1的ClustalX 1.83进行多重序列比对分析，再用Neighbor-joining法構建系统发育进化树。

1. 6 药敏试验

以无菌生理盐水将菌株FS170808的24 h培养物制成1.5×108 CFU/mL的菌悬液，取80.0 μL菌悬液涂布于营养琼脂培养基中，采用K-B纸片扩散法，用无菌镊子将抗生素纸片轻轻贴在琼脂培养基表面，28 ℃培养24 h后用游标卡尺测量抑菌圈直径。参考美国临床实验室标准化研究所（CLSI）的抗菌药物敏感性试验执行标准（Walker，1999）分析数据，从而判定菌株FS170808对26种抗生素的敏感性。

2 结果与分析

2. 1 自然发病鳜鱼的主要症状及病原菌的形态特征

患病鳜鱼腹部发红、肛门红肿。剖检可见肝脏充血，腹腔有血样腹水，肠壁充血严重（图1）。从肝脏分离获得的优势菌株FS170808为革兰氏阴性短杆菌，能运动；在SS琼脂培养基上生长，其菌落中央有黑色小点；在营养琼脂培养基上28 ℃培养24 h后，长出边缘整齐、凸起、正圆形、灰白色、湿润、直径约0.48 mm的菌落（图2）。

2. 2 人工感染试验结果

经人工感染发病鳜鱼的主要临床症状与自然感染菌株FS170808的鳜鱼症状相似，其腹部出血，肛门充血、外突。从死亡鳜鱼的肝脏中可再次分离到原感染菌株，说明菌株FS170808是引起鳜鱼发病死亡的病原菌。注射无菌生理盐水的对照组鳜鱼无死亡现象，外观特征无明显变化，剖检也未发现任何病理变化。根据寇氏法的计算法则计算可知菌株FS170808对鳜鱼的半致死剂量为9.5×105 CFU/mL（表1）。

2. 3 病原菌的生理生化特征

对菌株FS170808进行生理生化检测，并参照《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》进行判断，发现菌株FS170808与迟缓爱德华氏菌的表型特征基本一致，表现为能利用葡萄糖、麦芽糖和赖氨酸，可产生硫化氢，M.R.试验呈阳性（表2）。

2. 4 16S rDNA基因序列分析结果

通过PCR扩增获得菌株FS170808的16S rDNA基因片段为1407 bp。NCBI同源性分析结果表明，菌株FS170808与迟缓爱德华氏菌的同源性高达99%。基于16S rDNA基因序列构建的系统发育进化树也发现菌株FS170808与迟缓爱德华氏菌聚为一个分支（图3），综合生理生化检测结果和16S rDNA基因序列分析结果，确定菌株FS170808为迟缓爱德华氏菌。

2. 5 药敏试验结果

由表3可知，菌株FS170808对喹诺酮类的诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星，林可酰胺类的克林霉素，四环素类的四环素、米诺环素、多西环素，氨基糖苷类的丁胺卡那、庆大霉素、卡那霉素，β-内酰胺类的头孢哌酮、氨苄西林、羧苄西林、哌拉西林、头孢曲松、头孢唑林、头孢呋辛等高度敏感；对部分β-内酰胺类如头孢氨苄、头孢拉定、头孢他啶，氨基糖苷类的新霉素和多粘霉素类的多粘菌素B中度敏感；而对于磺胺类的复方新诺明、β-内酰胺类的苯唑西林、大环内酯类的麦迪霉素和多肽类的万古霉素已产生耐药性。

3 讨论

迟缓爱德华氏菌可分为野生型和生物型两类（邵建春，2016）。生物型迟缓爱德华氏菌能利用乳糖、蔗糖、甘露醇等糖类作为能源，不产生硫化氢气体，至今仅在水体和蛇中发现，尚无感染致病的报道（王波和莫照兰，2007）；而野生型迟缓爱德华氏菌与上述的生化指标恰好相反，且较常见。由于菌株FS170808不能利用乳糖、蔗糖、甘露醇作为能源，可产生硫化氢气体，故判定菌株FS170808为野生型迟缓爱德华氏菌。

鱼类迟缓爱德华菌病具有流行范围广、发病率和病死率高等特点（郑大海和麦康森，2004），其致病菌迟缓爱德华氏菌于1962年被Hoshina首次报道，目前已有20多种鱼类可感染迟缓爱德华氏菌并致病；该病菌还可感染人类，引起肠胃炎、流行性腹泻、脑膜炎或败血症等病症（程俊茗等，2017）。迟缓爱德华氏菌主要通过皮肤病灶或肠道进入鱼体内，并在肝脏或肾脏中生长增殖（靳仁娉，2012），致病过程一般分为黏附、侵入、抵抗宿主免疫反应、生长繁殖、产生毒素和酶等阶段。黏附的主要场所是鳃、胃肠上皮细胞和体表，可通过多种黏附素如血凝素、菌毛蛋白对宿主细胞表面进行黏附作用（Ling et al.，2001；Sakai et al.，2003），一旦进入组织或细胞中，菌体会借助Ⅲ型和IV型分泌系统来抵抗宿主的杀菌机制（Tan et al.，2005），期间会分泌一系列胞外酶如胶原酶、蛋白酶、软骨素和溶血素等协助菌体扩散至全身，从而使鱼体发生纤维素性化脓性炎症，病灶随后转移至其他器官，最后因败血症而导致死亡（Leung et al.，2012；Park et al.，2012）。

尽管免疫学治疗、生物防治（Patil et al.，2001；郭玉娟和陈学年，2006；陈树河等，2016）等新防治疾病手段相继出现，但由于养殖条件、经济效益、养殖户素质等的限制，抗生素治疗仍是细菌性疾病的主要治疗手段。本研究中，分离获得的鳜鱼源迟缓爱德华氏菌对新霉素具有中度敏感性，对复方新诺明、万古霉素等已产生耐药性。而前人的相关研究指出，宝石鱼（JadePerch）源迟缓爱德华氏菌对万古霉素中度敏感（叶旭红等，2010）、杂交鳢（Channa ma-culata ♀×C. argus ♂）源野生型迟缓爱德华氏菌对新霉素高度敏感（陈言峰等，2014）、黄鳝源迟缓爱德华氏菌对复方新诺明高度敏感（邵建春，2016）。可见，不同来源的迟缓爱德华氏菌对药物敏感性具有明显差异，可能与寄主本身及养殖过程中的用药差异相关。

4 结论

迟缓爱德华氏菌可引起鳜鱼发病死亡，生产养殖中可选用氨苄西林、头孢曲松、头孢呋辛、庆大霉素等高度敏感性药物进行防治。

参考文献：

陈树河，陈秋，常云胜，周维，王青华，丁燏. 2016. 复合益生菌在水产养殖中的作用机制研究进展[J]. 河南农业科学，45（4）：12-18. [Chen S H，Chen Q，Chang Y S，Zhou W，Wang Q H，Ding Y. 2016. Research advance on application mechanisms of multispecies probiotic in aquaculture[J]. Journal of Henan Agricultural Sciences，45（4）：12-18.]

陈言峰，周爱国，陈冠锋，陈建酬，张继平，张辉华. 2014. 养殖杂交鳢迟缓爱德华菌的分离鉴定[J]. 南方水产科学，10（5）：1-7. [Chen Y F，Zhou A G，Chen G F，Chen J C，Zhang J P，Zhang H H. 2014. Isolation of Edwardsiella tarda from cultured hybrid snakehead（Channa maculata ♀×C. argus ♂） and its identification[J]. South China Fishe-ries Science，10（5）：1-7.]

陈言峰，卓孝磊，王超，郑宗正，付强. 2017. 鲮鱼致病性迟钝爱德华氏菌的鉴定及药敏分析[J]. 水产科学，36（1）：48-53. [Chen Y F，Zhuo X L，Wang C，Zheng Z Z，Fu Q. 2017. Identification and analysis of antibiotic sensitivity of pathogenic bacterium Edwardsiella tarda from cultured mud card[J]. Fisheries Science，36（1）：48-53.]

程俊茗，万明月，周晋扬，贾丹，胡鲲. 2017. 鲫源迟缓爱德华氏菌的分离鉴定及其毒力基因的检测[J]. 微生物学通报，44（10）：2380-2390. [Cheng J M，Wan M Y，Zhou J Y，Jia D，Hu K. 2017. Identification and virulence genes detection of Edwardsiella tarda isolated from Carassius auratus gibelio[J]. Microbiology China，44（10）：2380-2390.]

馮艺，杨树浩，杨映，吴勇亮，陈建酬. 2017. 罗氏沼虾费氏柠檬酸杆菌的分离鉴定及药敏分析[J]. 中国兽医科学，47（11）：1141-1147. [Feng Y，Yang S H，Yang Y，Wu Y L，Chen J C. 2017. Isolation and identification of Citrobacter freundii from diseased Giant freshwater prawn（Macrobrachium rosenbergii）[J]. Chinese Veterinary Science，47（11）：1141-1147.]

郭玉娟，陳学年. 2006. 肽聚糖对鲫鱼嗜水气单胞菌灭活疫苗免疫增强效果的研究[J]. 中国兽医科学，36（1）：33-36. [Guo Y J，Chen X N. 2006. Enhancement of A3α-peptidoglycan on immune effect of inactivated vaccine against Aeromonas hydrophila[J]. Veterinary Science in China，36（1）：33-36.]

黄嘉荣. 2016. “生态基”养鳜鱼新模式[J]. 海洋与渔业，17（12）：36-37. [Huang J R. 2016. “Ecological basis”：A new model raising Siniperca chuatsi[J]. Ocean & Fishery，17（12）：36-37.]

靳仁娉. 2012. 迟缓爱德华氏菌唾液酸酶的克隆表达与功能研究[D]. 青岛：中国海洋大学. [Jin R P. 2012. Cloning，expression and functional analysis of Edwardsiella tarda sialidases[D]. Qingdao：Ocean University of China.]

李翠萍，吴民耀，王宏元. 2012. 3种半数致死浓度计算方法之比较[J]. 动物医学进展，33（9）：89-92. [Li C P，Wu M Y，Wang H Y. 2012. LC50 caculated by Kochi，Probit ana-lysis and Linear regression methods[J]. Progress in Vete-rinary Medicine，33（9）：89-92.]

邵建春. 2016. 黄鳝源迟缓爱德华氏菌的鉴定、分型及全基因组测序[D]. 武汉：华中农业大学. [Shao J C. 2016. Identification，genotyping and whole genome sequencing of Edwardsiella tarda from Asian swamp eel（Monopterus albus）[D]. Wuhan：Huazhong Agricultural University.]

孙莉娜. 2016. 迟钝爱德华氏菌生物被膜状态下耐药相关基因与蛋白的研究[D]. 福州：福建农林大学. [Sun L N. 2016. Studies on the genes and proteins related to the antibiotic resistance in Edwardsiella tarda biofilm[D]. Fuzhou：Fujian Agriculture and Forestry University.]

王波，莫照兰. 2007. 迟缓爱德华氏菌及其致病机理[J]. 海洋科学集刊，48：133-139. [Wang B，Mo Z L. 2007. Edwardsiella tarda and its pathogenesis[J]. Studia Marina Sinica，48：133-139.]

叶旭红，林先贵，王一明. 2010. 养殖澳洲宝石鱼迟缓爱德华氏菌的分离鉴定及致病基因的检测[J]. 淡水渔业，40（1）：50-54. [Ye X H，Lin X G，Wang Y M. 2010. Identification and detection of virulence of the pathogenic bacteria Edwardsiella tarda in cultured Scortum barcoo[J]. Freshwater Fisheries，40（1）：50-54.]

郑大海，麦康森. 2004. 迟钝爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）研究概况[J]. 海洋湖沼通报，26（1）：52-59. [Zheng D H，Mai K S. 2004. Review of studies on Edwardsielia tarda[J]. Transactions of Oceanology and Limnology，26（1）：52-59.]

Hoshina T. 1962. On a new bacterium，Paracolobactrum anguillimortiferum n. sp[J]. Bulletin of the Japanese Socie-ty of Scientific Fisheries，28（2）：162-164.

Huo H H，Yin S T，Jia R，Huang B，Lei J L，Liu B L. 2017. Effect of crowding stress on the immune response in turbot（Scophthalmus maximus） vaccinated with attenuated Edwardsiella tarda[J]. Fish & Shellfish Immunology，67：353-358.

Leung K Y，Siame B A，Tenkink B J，Noort R J，Mok Y K. 2012. Edwardsiella tarda—Virulence mechanisms of an emerging gastroenteritis pathogen[J]. Microbes & Infection，14（1）：26-34.

Ling S H，Wang X H，Lim T M，Leung K Y. 2001. Green fluorescent protein-tagged Edwardsiella tarda reveals portal of entry in fish[J]. Fems Microbiology Letters，194（2）：239-243.

Park S B，Aoki T，Jung T S. 2012. Pathogenesis of and strategies for preventing Edwardsiella tarda infection in fish[J]. Veterinary Research，43（1）：67.

Patil R，Jeyasekaran G，Shanmugam S A，Shakila R J. 2001. Control of bacterial pathogens，associated with fish di-seases，by antagonistic marine actinomycetes isolated from marine sediments[J]. Indian Journal of Marine Sciences，30（4）：264-267.

Sakai T，Kanai K，Osatomi K，Yoshikoshi K. 2003. Identification of a 19.3-kDa protein in MRHA-positive Edwardsiella tarda：Putative fimbrial major subunit[J]. Fems Microbiology Letters，226（1）：127-133.

Su Y B，Peng B，Han Y，Li H，Peng X X. 2015. Fructose restores susceptibility of multidrug-resistant Edwardsiella tarda to kanamycin[J]. Journal of Proteome Research，14（3）：1612-1620.

Tan Y P，Zheng J，Tung S L，Leung K Y. 2005. Role of type III secretion in Edwardsiella tarda virulence[J]. Microbio-logy，151（7）：2301-2313.

Walker R D. 1999. Standards for antimicrobial susceptibility testing[J]. American Journal of Veterinary Research，60（9）：64-65.

Wang L，Xiao J，Cui S，Wang Q，Wu H. 2014. HU-induced polymorphous filamentation in fish pathogen Edwardsie-lla tarda leading to reduced invasion and virulence in zebrafish[J]. Veterinary Microbiology，171（1-2）：165-174.

Xu T，Zhang X H. 2014. Edwardsiella tarda：An intriguing problem in aquaculture[J]. Aquaculture，431（2）：129-135.

（責任编辑 罗 丽）