蒋谦才 谭宗健 廖浩斌 刘盼盼 孙红梅 王瑞江 曹洪麟 黄向旭 赖思茹 梁丹 王峥峰

摘 要：土沉香（Aquilaria sinensis）是生產中药沉香的重要树种，现被列为国家二级重点保护野生植物。该研究通过采集该地区83株土沉香样品，利用限制性酶切位点相关DNA测序（restriction siteassociated DNA sequencing，RADseq）方法获得的18个微卫星体作为分子标记，计算了五桂山土沉香种群的整体观测杂合度（observedheterozygosity）、期望杂合度（expectedheterozygosity）、种群整体近交系数及其个体间的亲缘关系，并对种群可能经历的种群缩小或种群扩张状况进行了分析。结果表明：与同属其它物种以及同一生活史物种相比，五桂山地区土沉香遗传多样性略低（观测杂合度和期望杂合度分别为0.523和0.522），但种群整体处于随机交配状态（近交系数为-0.002）。瓶颈效应分析表明该种群没有经历瓶颈效应，且81.810%的个体间无亲缘关系，说明这一地区土沉香并非少数个体发育起来；种群扩张分析表明其种群大小有增长情形。综合这些结果可以看出，中山市五桂山土沉香种群整体遗传健康状况良好，较好地保存了该区域种质资源遗传多样性，为今后的保护和合理开发提供了优质资源储备。

关键词：瓶颈效应，亲缘关系，微卫星体，遗传变异，种群扩张

中图分类号：Q319+.1

文献标识码：A

文章编号：10003142（2018）06080408

Abstract：Aquilaria sinensis，famous of its fragrant wood，is listed as national Level Ⅱ protected wild plants. For sound conservation this precious population of A. sinensis in Wuguishan District of Zhongshan City，we conducted genetic diversity surveys on it. Because population history such as shrinking or expansion would definitely leave signatures in population genetic variations，based on the genetic diversity investigated in Wuguishan population of A. sinensis，we also made population history inferences for it. Among genetic diversity studies，microsatellite markers are the most suitable tools due to their high polymorphism. Therefore，using eighteen microsatellites obtained by restriction siteassociated DNA sequencing （RADseq），we examined the genetic diversities of 83 A. sinensis individuals collected from Wuguishan District，and estimated genetic diversity parameters by observedheterozygosity，expectedheterozygosity and inbreeding index. Because the genetic relationship between individuals could reflect whether Wuguishan population of A. sinensis was derived from a few ancestors，pairwise genetic relatedness was calculated and four types of relationship （parentoffspring，fullsiblings，halfsiblings and unrelated） between individuals were determined. The population history was inferred for population shrinking （bottleneck） or expansion. Overall，compared to the genetic variation of the species in the same genus and the species with similar life history traits，the genetic diversity in Wuguishan population was slightly low with the observedheterozygosity and expectedheterozygosity being 0.523 and 0.522，respectively. The value of -0.002 for inbreeding index，which was close to zero，indicated that the whole population was under random mating. Bottleneck analysis indicated bottleneck effects did not happened recently in Wuguishan population，which meant no population shrinking. Pairwise relationships between individuals confirmed this by showing most of individual pairs （>81.810%） were unrelated. Finally，we detected the evidence of population expansion on the basis of allele size distributions. Accordingly，these results indicated that Wuguishan population of A. sinensis is generally genetically healthy. Such information provides the reference for the conservation and the reasonable uses of A. sinensis in the future.

Key words：bottleneck effects，genetic relationship，microsatellites，genetic variation，population expansion

土沉香（Aquilaria sinensis）为瑞香科（Thymelaeaceae）沉香属（Aquilaria）多年生热带、亚热带常绿乔木，是中国特有物种。它为国产中药沉香的正品来源，也是我国生产中药沉香的唯一植物资源（贾文杰等，2010）。沉香不仅是我国传统中药材，更列为十大广药之一。但土沉香的结香是一个复杂的生物物理化学过程，其香气至今无法人工合成。沉香被喻为植物中的钻石，十分珍贵。野生土沉香主要分布于我国广东、广西、海南、云南等省（区），但在福建、台湾、四川等省有栽培。由于人们为牟取暴利滥采乱伐，土沉香遭到严重破坏，再加上其天然更新能力弱，导致土沉香野生资源日趋减少。目前，土沉香被列为国家二级重点保护野生植物（《国家重点保护野生植物名录》，1999），也被IUCN列为禁止贸易的种类。2016年广东省颁布的《广东省岭南中药材保护条例》把包括土沉香在内的八种极具岭南特色的中药材作为首批地方特色资源进行保护和开发，以实现规范利用沉香资源，促进地区土沉香产业持续健康发展。沉香在我国具有悠久的历史，其之誉源于隋唐，盛于宋代。而东莞地区是土沉香最主要种植地，品质最优。古时东莞为东莞县，地域广大，包括了现在的香港、深圳、宝安、中山及东莞市（梅全喜等，2007）。中山市原名香山县，是东莞地区沉香中心和最主要产地（梅全喜等，2007，2011），即以“地宜香木”得名，是“中国沉香之乡”，也是东莞地区沉香和“道地”性代表。虽然中山市土沉香也历经盗砍盗伐等破坏，但在其境内五桂山及其周边风水林中还残存一些较大土沉香植株，极具保护价值（梅全喜，2016）。五桂山是中山市的主要山脉，其中蕴含丰富的物种资源，其中以土沉香最为著名。截止至今，当其他地区的原始土沉香资源由于各类原因减少消失，五桂山还保留有众多较原始土沉香，是这一区域土沉香资源宝库，具有很重要的开发利用潜力。

遗传多样性是物种长期生存适应的基础（季维智和宿兵，1999；Shi，1993；Lankau & Strauss，2007；Kettenring et al，2014）。1980年的《世界自然资源保护大纲》和1992年《生物多样性保护公约》中都把保护物种遗传多样性作为其中主要目标。2014年我国又颁布了《加强生物遗传资源管理国家工作方案（2014—2020年）》和《生物多样性保护重大工程实施方案（2014—2020年）》。遗传多样性对于林业生产同样具有非常重要的作用。2013年，联合国粮农组织制定了《森林遗传资源养护、可持续利用和开发全球行动计划》；2015年我国国家林业局《中国林业遗传资源保护与可持续利用行动计划（2015—2025年）》把林业遗传资源作为我国战略资源，从调查、收集、保护、评价和利用等多个方面阐述了我国林业遗传资源的至关重要性，表明当前对我国林木遗传多样性的调查、保护和开发的迫切需求。因此开展中山市五桂山地区土沉香遗传多样性研究对于合理保护和开发这一珍贵的物种资源具有重要意义。针对此，利用微卫星体分子标记，我们开展如下两方面的研究：（1）探讨五桂山土沉香整体遗传多样性（大小）状况。（2）考虑到历史上对土沉香的破坏，利用遗传多样性数据，了解土沉香种群形成历史状况。包括五桂山土沉香种群是否经历过瓶颈效应？个体间亲缘关系如何？是否由较少残留的个体发展起来的（导致个体间亲缘关系很近）？种群形成过程是否有自然扩张情形？即种群大小是否一直保持恒定，还是有明显的扩大。

1 材料与方法

1.1 研究地点和样品采集

研究地位于广东省中山市五桂山生态保护区内，五桂山生态保护区位于广东省中南部，地处珠江出海口，地理坐标为113°20′—113°35′ E，22°16′—22°27′ N之间，属亚热带季风气候，光热充足，雨量充沛，年均气温为22.0 ℃，极端最高气温36.7 ℃，极端最低气温-1.3 ℃，年均降水量为1 738 mm（蒋谦才等，2005）。研究区域内土壤类型为赤红壤，植被代表类型为热帶季雨林型的常绿季雨林。五桂山主峰海拔531 m，是中山市最高峰；为中山市的“市肺”，总面积198.3 km2，是珠江口西岸唯一的大面积森林绿地（樊风雷等，2013）。五桂山生态保护区内动植物资源丰富（蒋谦才等，2005，2006，2011；林俊新等，2006；黎清等，2011；张玉山等，2012），蕴含多种珍稀濒危植物，包括极具特色的土沉香。

在五桂山土沉香集中分布地区采集胸径级大于5 cm的土沉香成熟个体，每株采集2～3片叶子，叶片采集后立刻放入装有硅胶的密封袋内带回实验室。本研究共采集到83株土沉香叶样。

1.2 遗传多样性检测

利用中国科学院华南植物园王峥峰所在实验室筛选到的18个微卫星体对五桂山83株土沉香样品进行PCR扩增。这18个微卫星体采用限制性酶切位点相关DNA测序（restriction siteassociated DNA sequencing，RADseq）方法获得。具体步骤如下，首先利用中国科学院植物园采集的一个土沉香样品，通过EcoR I内切酶对它的总DNA进行酶切。收集350～500 bp片段进行建库。再利用Illumina HiSeq 2500测序仪进行双端150 bp测序。对测序结果进行过滤、拼接。对拼接后的序列参考王峥峰（2016）方法进行微卫星体序列的查找。对查找到的微卫星体序列，我们随机挑选其中100个序列进行引物设计，多态性分析。最终确定18个有稳定多态性的微卫星体进行土沉香遗传多样性研究。每个微卫星体PCR扩增均使用20 μL反应体系，体系如下：2 μL 10× PCR 缓冲液，0.5 mmol·L1 dNTPs，正反引物各0.4 μmol·L1，约50 ng DNA模板，1 U Taq酶。PCR反应程序如下：起始5 min 95 ℃变性，随后35个循环进行94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35个循环结束后72 ℃延伸10 min。每个微卫星体均使用相同的退火温度。PCR扩增产物在ABI 3730全自动测序仪上用毛细管电泳法进行微卫星体分型分析。

1.3 数据分析

土沉香遗传多样性分析：利用GenAlEx 6.501（Peakall & Smouse，2012）計算五桂山土沉香种群各位点等位基因数，各位点及其种群整体观测杂合度（Observedheterozygosity）和期望杂合度（Expectedheterozygosity）；利用Genepop4.5.1软件（Rousset，2008） 计算种群各位点及其种群整体近交系数f（Weir & Cockerham，1984），检测其显著性，并采用Bonferroni 纠正（Bonferroni correction）的方法进行多重比较下的显著性水平调整（Holm，1979）。f值反映种群是否处于哈迪—温伯格平衡（HardyWeinberg Equilibrium），一种自由交配状况。如果种群处于这一平衡，f值为0。考虑到其中一个位点TCX22明显偏离哈迪—温伯格平衡（见结果与分析），在下面三个分析中，我们去除了TCX22位点。

种群瓶颈效应利用BOTTLENECK1.2.02（Piry et al，1999）进行分析。在微卫星突变模型选择上，这里选择两相突变模型（Twophased model of mutation），用威尔科克森符号秩检验（Wilcoxon SignedRanks Test）法进行瓶颈效应显著度检测。

个体间亲缘关系利用MLrelate（Kalinowski et al，2006）软件进行分析。MLrelate软件通过计算两两个体间的亲缘系数，检测个体之间如下亲缘关系：亲本—子代（PO，parentoffspring）关系，全同胞（FS，fullsiblings）关系，半同胞（HS，halfsiblings）关系和无关系（U，unrelated）四种类型。

种群扩张采用kgtests软件（Bilgin，2007）中的Ktest方法进行分析。这一方法的原理是对于扩张的种群，它的等位基因大小分布呈单峰性（Unimodal）；而对于种群大小恒定的种群，其等位基因大小分布呈多峰性（Multimodal）。Ktest中的k度量峰度（Kurtosis）状态，中间值为0。位点k值小于0表示有种群扩张的情形。如果所有检测位点中k值小于0的位点比例显著占优，就表示种群有扩张历史。

2 结果与分析

2.1 遗传多样性

18个微卫星体在五桂山土沉香种群中分别扩增出2～13个等位基因，观测杂合度在0.049～0.831之间，期望杂合度在0.094～0.800之间。近交系数检测结果表明除了TCX22这个位点偏离哈迪—温伯格平衡，其余位点均处于哈迪—温伯格平衡状态（表1）。图1为五桂山部分土沉香个体在TCX40位点的毛细管电泳结果。

种群水平的遗传多样性结果表明，五桂山土沉香观测杂合度和期望杂合度分别是0.523和0.522，非常接近。近交系数也接近0，表明种群整体处于哈迪—温伯格平衡。

2.2 瓶颈效应分析

利用微卫星体的两相突变模型，瓶颈效应分析中威尔科克森符号秩检验结果是P=0.189，结果不显著，表明五桂山土沉香没有经历瓶颈效应。

2.3 个体间亲缘关系分析

55个个体对表现为亲本—子代关系，占全部个体对的1.616%（55/3 403），41个个体对表现为全同胞关系，占全部个体对的1.205%（41/3 403），523个个体对表现为半同胞关系，占全部个体对的15.369%（523/3 403）。其余2 784个个体对表现为没有亲缘关系，占81.810%。

2.4 种群扩张分析

种群扩张分析的ktest结果显示，检测的17个微卫星体位点中，13个位点k值小于零（P=0.018），表明五桂山土沉香历史上有种群扩张情形。

3 讨论与结论

利用ISSR（intersimple sequence repeat）和AFLP（amplified fragment length polymorphism）不同分子遗传标记，贾文杰等（2010）、杨春勇等（2013）和黄久香等（2014）都对土沉香遗传多样性开展过一些研究。结果表明土沉香物种水平上拥有较高的遗传多样性，但种群水平遗传多样性相对低些。由于ISSR和AFLP分子遗传标记为显性遗传标记，无法区分杂合体，限制了其在物种交配系统、亲本分析等领域的应用。但由于其能揭示丰富的遗传多样性信息，因此ISSR和AFLP分子遗传标记还是有其优越性。

本研究通过文献查找，利用微卫星体分子标记，对土沉香同属植物开展的研究只有马来沉香（Aquilaria malaccensis）。而Singh et al（2015）的研究混合了三个种群观测杂合度和期望杂合度结果，因此这两个值的结果都较高于五桂山土沉香种群遗传多样性。但与Tnah et al（2012）对马来沉香种群水平的遗传多样性结果相比，五桂山土沉香遗传多样性的两个指标略低。

本研究中，与同一生活史其它物种相比，五桂山土沉香种群遗传多样性两个指标（观测杂合度和期望杂合度）都较低，其观测杂合度和期望杂合度只高于种子重力传播的物种。贾文杰等（2010）研究认为，土沉香的种子兼具重力传播和摄食传播两种方式。土沉香种子褐色，卵球形，长约1 cm，宽约5.5 mm。土沉香种子具有拟态性，种子附属物可分泌化学信号诱导胡蜂取食，胡蜂取食时同时协助土沉香种子扩散（胡超，2012；Chen et al，2016）。对同属其它物种马来沉香（A. malaccensis）种子扩散研究表明，黄腰胡蜂（Vespa affinis）是其唯一种子传播者，最长可以协助马来沉香种子扩散到500 m以外（Manohara，2013）。考虑到土沉香种子的这种特性，其种子传播方式应该归为摄食传播。因此，在种子传播方式上，土沉香遗传多样性应该和种子摄食传播物种相比。本研究中，种子摄食传播物种的遗传多样性两个指标，观测杂合度和期望杂合度，分别为0.72和0.73，高于五桂山土沉香种群这两个遗传多样性指标。综上，我们可以看出，五桂山土沉香种群遗传多样性略低，但总体并没有很大下降。同时，从近交系数f结果看，其值约为0，反映种群整体呈随机交配状况。

由于缺乏历史资料，虽然现有五桂山土沉香种群散布在次生林中，并且有些个体胸径级较大，如胸径为33.9 cm，但其原始性尚无法判斷。虽然从现代规模化种植角度看，这些散生的土沉香个体不像是人为种植的，但考虑到中山市自唐宋以来是传统的土沉香种植区，存在大规模的人工种植现象，因此五桂山现有的土沉香很有可能是当年人工种植的土沉香种子扩散后萌发而成。

人工栽培会导致栽培物种遗传多样性的明显降低，这在很多栽培作物中有报道（Fineschi et al，2000；Lumaret et al，2004；Allan et al，2008；Li et al，2017；Sahu & Chattopadhyay，2017）。主要原因是人们在进行人工栽培中会选择某种优良性状的个体作为母系，然后后代均从这些少数母系繁育而来，从而导致栽培群体来源单一，遗传多样性降低。同时，从以往对土沉香不同种群遗传分化的结果看，土沉香种群间存在较大的遗传分化。如黄久香等（2014）对东莞及其邻近地区的土沉香种群的遗传分化研究结果为0.227；而贾文杰等（2010）对广东、广西、云南以及海南共8个种群的研究结果表明，土沉香种群间的遗传分化达0.443。理论研究表明（Wright，1978），当遗传分化值为0～0.05之间，种群间遗传分化程度低；当遗传分化值为0.05～0.15之间，种群间的遗传分化程度中等；当遗传分化值为0.15～0.25之间，种群间的遗传分化程度较大；当遗传分化值大于0.25时，种群间的遗传分化程度很大。对比以往的结果，土沉香种群间有较大的遗传分化，这导致种群间基因流不畅，降低种群内遗传多样性。因此，理论上看，人工栽培和基因流不畅都会导致土沉香种群遗传多样性的降低。然而从我们的研究结果看，五桂山土沉香并没有出现大的遗传多样性降低。其可能的原因是五桂山地区土沉香人工栽培种植面积较大，种源选择较广，使得五桂山土沉香种群形成没有受到瓶颈效应（个体数量限制）影响。个体间亲缘关系远也证实了这点。虽然没有很大的遗传多样性降低，但从上面的对比分析看，人工选择栽培还是在一定程度上造成五桂山地区土沉香小部分遗传多样性丢失。近年来，有多人次对五桂山地区土沉香资源进行过相关调查，估计其种群数量可达约4万株（梅全喜，2016），表明这一地区现有土沉香种群生长状况良好，符合我们对其种群扩张的检测结果。

综上所述，从现有结果来看，五桂山土沉香种群遗传多样性稍低，种群整体健康，为该地区土沉香保护利用提供了遗传多样性保障。

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