刘佳 吴能表

摘 要：为了研究不同濃度AgNO3对颠茄毛状根生长过程中托品烷类生物碱及影响其合成关键酶基因表达的影响，该研究使用五种不同浓度的AgNO3处理黑暗培养12 d的颠茄毛状根，2 d后收集毛状根并测定其鲜、干质量、托品烷类生物碱的含量、部分生理指标（MDA、Pro、可溶性糖、可溶性蛋白）、关键酶基因（pmt、trI、h6h）表达量。结果表明：AgNO3虽然抑制了颠茄毛状根的生长，但却促进了托品烷类生物碱的积累，与对照相比，50、100、150 μmol·L1处理均显著性地提高了托品烷类生物碱的产量。同时在150 μmol·L1处理下，毛状根代谢途径中MDA与对照相比均具有显著性的提高，脯氨酸含量在150 μmol·L1下也有了显著性提高，达到了5.92 μg·g1FM，是对照的2.91倍。可溶性糖与可溶性蛋白含量在150 μmol·L1浓度下处理时其含量分别是对照的1.55倍和1.67倍。托品烷类生物碱合成过程中关键酶基因（pmt、trI、h6h）的表达量在不同浓度AgNO3处理下均有不同程度的提高。由此可以推断，AgNO3在150 μmol·L1处理下，可能通过调控脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖这几种初级代谢产物或某几种关键酶基因的表达来影响颠茄毛状根托品烷类的合成。

关键词：颠茄，硝酸银，托品烷类生物碱，毛状根，基因表达量

中图分类号：Q943

文献标识码：A

文章编号：10003142（2018）06078107

Abstract：In this study，we studied the influences of different concentrations of AgNO3 on tropane alkaloids and key enzyme genes in metabolic pathway. We all know that the accumulation of plant secondary metabolites is directly related to some tprimary metabolism and activity of key enzymes. And AgNO3 is a heavy metal，which can induce oxidative stress in plants and which has a great effect on plant growth and key enzymes of metabolism. Therefore，we added five concentrations of AgNO3 into Atropa belladonna hairy roots，and cultivated in B5 liquid medium for 12 d，and then，we collected hairy roots and determined fresh weight，dry weight，contents of tropane alkaloids，some physiological indexes included MDA，Pro，soluble sugar and soluble protein，genes expression level after cultivated for 2 d. The results showed that AgNO3 promoted the accumulation of the alkaloids，although AgNO3 inhibited the growth of hairy roots，50，100，150 μmol·L1 AgNO3 could improve the contents of tropane alkaloids compared with control. Meanwhile，150 μmol·L1 treatment group significantly improved the hairy roots of the content of MDA compared with control. As well as the content of Pro increased to 5.92 μg·g1FM，2.91 times of control. Then，the contents of soluble sugar and souble protein were significantly improved 1.55 and 1.67 times of control respectively by treating with 150 μmol·L1 AgNO3 treatment. Thus，with the treatment of AgNO3，gene expressions （pmt，trI，h6h） of key enzymes in the metabolic pathway of A. belladonna hairy roots all increased their produced effects. Therefore，we could be inferred that the contents of tropine alkaloids in A. belladonna hairy roots could regulate and control primary metabolism such as Pro，soluble protein，soluble sugar and secondary metabolism like expressions of key enzyme genes with the treating of AgNO3. This study could provide the basic theories for study the synthesis mechanism of tropane alkaloids and an effective method to enhance the medicinal composition in the culture of hairy roots of Atropa belladonna in the future.

Key words：Atropa belladonna，AgNO3，tropane alkaloids，hairy roots，expression of gene

顛茄（Atropa belladonna），俗名野山茄、颠茄草，茄科颠茄属多年生草本植物（中国药典，2015）。颠茄是一种常见且常用的药用植物，全草可入药，叶和根含莨菪碱与东莨菪碱，临床上可制成配剂和浸膏用于麻醉、镇痛、抗晕动症等（肖培根，2002）。已有研究表明，药用植物中含有多种有效的活性物质，对人类的健康和发展都有着重要的作用（Verpoorte & Memelink，2002）。然而，随着市场需求的不断变化，加之长期不当的采伐及生态环境的破坏，使药用植物中的活性物质含量越来越低，成为药用植物进军国际市场的一大瓶颈（Namdeo，2007）。

近年来，毛状根培养技术已在植物次生代谢产物的生产、品种改良和特种植物栽培等领域有了广泛且有效的应用（Georgiev et al，2007）。在植物生长期间添加诱导子也是提高多种植物次生代谢产物含量的有效途径。诱导子能够引起植物体内特殊的次生代谢产物的合成，所以诱导子成为一种提高毛状根生产次生代谢产物的有效方法（Savitha et al，2006）。AgNO3是一种重金属，可诱导植物体内的氧化胁迫，从而对植物的生长及代谢产生较大的影响（Vasconsuelo & Boland，2007）。一般来说，植物次生代谢产物的积累都会与代谢过程中关键酶的活性有直接或间接的关系。如黄蕾等（2013）的研究发现，硝酸铅可促进花楸悬浮细胞的生长并刺激次生代谢产物的积累。目前对颠茄的研究主要集中在代谢途径中关键酶基因克隆的研究（强玮，2012）；通过调控次生代谢产物中关键酶基因的过量表达来提高颠茄托品烷类生物碱含量（李金娣等，2013）。这种方法成本较高不利于大规模生产，同时基因的过表达可能会存在嵌合体，导致遗传的不稳定。但目前尚未见通过添加诱导子来研究其对颠茄毛状根生物碱含量以及代谢过程中关键酶基因影响的相关报道。本研究以颠茄毛状根为材料，通过添加AgNO3探究诱导子对颠茄毛状根的生长及代谢过程中关键酶基因表达的影响，旨在为提高颠茄药用成分有效研究提供参考，为颠茄毛状根的进一步扩大培养提供了依据，同时对颠茄托品烷类生物碱的合成调控机理的研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

西南大学三峡库区生态环境教育部重点实验室保存在B5培养基上的颠茄毛状根。

1.2 方法

1.2.1 AgNO3的制备 将AgNO3用蒸馏水溶解定容，配制成100 μmol·L1的母液，过0.22 μm滤膜除菌备用。

1.2.2 诱导子的添加及培养 将0.5 g新鲜颠茄毛状根接于150 mL 含有B5液体培养基的250 mL三角瓶中，110 r·min1、恒温、（25±1） ℃避光培养12 d，将原有培养基倒掉，换成添加不同浓度AgNO3的新鲜液体培养基，使AgNO3终浓度均分别为25、50、100、150、200 μmol·L1。相同条件下培养2 d。

1.2.3 毛状根鲜、干质量的测定方法 收集处理后的毛状根，用蒸馏水冲洗毛状根上残留的液体培养基，滤纸吸干水分后称重，即为毛状根的鲜质量。将新鲜的毛状根于60 ℃烘箱中烘干至恒重后称重，即为毛状根的干质量。

1.2.4 颠茄毛状根中托品烷类生物碱的提取 参照Zrate et al（1997）的提取方法，略有改动：将毛状根于烘箱中60 ℃烘干至恒重，充分研磨，过50目筛；称取0.100 0 g加10 mL提取液（CHCl3-MeOH-NH4OH（15∶5∶1）），超声提取30 min，室温放置过夜。提取液抽滤，2 mL CHCl3冲洗残渣，合并所有滤液；40 ℃真空浓缩至干，残留物用5 mL CHCl3和2 mL 1 mol·L1 H2SO4溶解，静置分层，收集硫酸相，浓氨水调pH至10，再分别加入4 mL CHCl3提取两次，静置；分层后取下层于40 ℃真空浓缩，残留物用1 mL甲醇溶解，即为样品液。0.22 μm滤膜过滤，-4 ℃保存备用。

1.2.5 色谱条件 色谱柱为Ultimate XBC18色谱柱（5 μm，4.6 mm × 250 mm）；流动相为甲醇∶醋酸铵（pH4.6）=58∶42；流速为1.0 mL·min1；检测波长为215 nm；柱温为40 ℃；进样量为10 μL。

1.2.6 部分生理指标测定 脯氨酸、可溶性蛋白含量的测定参照高俊凤（2006）的方法；MDA含量的测定采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法（赵世杰等，1991）；可溶性糖含量的测定采用蒽酮比色法（李合生，2000）。

1.2.7 关键酶基因表达量的测定 使用Biospin Plant Total RNA Extraction Kit 试剂盒提取总RNA，Promega GoScript试剂盒反转录，合成cDNA。以cDNA为模板，pgk为内参基因，使用Promega GoTaq qPCR Master Mix试剂盒进行荧光定量PCR。反应结束后，分析溶解曲线、扩增曲线和标准曲线，最终得到各基因的表达量。PCR所用的引物见表1。

1.3 数据分析

采用Microsoft Excel 2007和SPSS 22.0对数据进行统计整理和方差分析，Origin 8绘图。数据均以x ± s表示。

2 结果与分析

2.1 AgNO3对颠茄毛状根的生长及托品烷类生物碱的影响

从表2可以看出，AgNO3抑制了颠茄毛状根的生长，毛状根的鲜质量随试验浓度的增加逐渐降低，浓度大于100 μmol·L1时抑制作用与对照相比均有了显著性提高；而干质量在各处理组均表现出显著性地抑制，最高浓度时抑制效果最明显，仅为对照的73.64%。虽然AgNO3对颠茄毛状根的生长产生了抑制作用，但其托品烷类生物碱的含量却提高了，东莨菪碱的含量在50、100、150 μmol· L1时与对照相比有了显著性的增加，100 μmol· L1时含量达到了对照的2.5倍，莨菪碱的含量被AgNO3处理后均有显著性地提高；最终50、100、150 μmol·L1处理组与对照相比依然提高了托品烷类生物碱的产量，且均具有显著性。

2.2 AgNO3对颠茄毛状根生长过程中部分生理指标的影响

从图1可以看出，除25 μmol·L1处理外，其余四组处理均显著地增加了MDA的含量，150 μmol·L1处理效果最为明显，是对照的1.24倍；其次毛状根中脯氨酸的含量也因为AgNO3的添加全都有了显著性地提高，150 μmol·L1处理达到5.92 μg·g1FM，是对照的2.91倍，且与25、50、200 μmol·L1处理具有显著性差异；各处理组可溶性糖与可溶性蛋白的含量与对照相比也都有了显著性提高，其中可溶性糖含量在150与200 μmol·L1处理时其含量分别是对照的1.55、1.52倍，且与25、50 μmol·L1处理具有显著性差异。可溶性蛋白含量在50、150 μmol·L1两组处理中含量的提高均比较明显，分别达到了10.228、9.949 mg·g1FM，较对照分别增加了20.08%、16.78%，同时这两组处理与25、50 μmol·L1处理具有显著性差异。

2.3 诱导子对毛状根托品烷类生物碱关键基因表达量的影响

从图2可以看出，五种浓度AgNO3均能显著刺激pmt基因的表达，50、100 μmol· L1处理组分别为对照的3.45倍和3.32倍，且与25、200 μmol· L1诱导处理组均存在显著性差异；其次，除200 μmol· L1处理组外的四种浓度处理均可显著地刺激trI基因的表达，50、100 μmol·L1处理与其他三组存在显著性差异；最后，在h6h基因的表达中，200 μmol·L1处理组与对照相比没有显著性地提高表达，而其他四组可以显著性地提高h6h基因的表达，100 μmol·L1处理组对该基因的诱导效果最强烈，较对照基因表达量提高了1.16倍。

3 讨论与结论

AgNO3作为一种非生物诱导子，可诱导植物体内的氧化及胁迫，从而对植物的生长及代谢产物产生影响（Vasconsuelo & Boland，2007），因此，近几年越来越多的被用于植物次生代谢产物含量的提高。本研究发现：不同浓度的AgNO3均抑制了颠茄毛状根的生长，这可能是因为AgNO3对植物的营养吸收、呼吸作用、光合作用等生物學进程产生了干扰（Clemens，2006）。虽然颠茄毛状根的生长受到了抑制，但东莨菪碱的含量在50、100、150 μmol· L1时有了显著性的增加。这一方面可能是因为颠茄毛状根在受到AgNO3的胁迫后，产生可溶性糖、可溶性蛋白等来预防这种胁迫，这些初级代谢产物的产生会使多余的初级代谢产物转化成次级代谢产物，另一方面也有可能是因为AgNO3诱导颠茄托品烷类生物碱代谢过程中关键酶基因的表达，如Xiao & Gao（2010）用Ag+处理丹参毛状根后，在第6天的mRNA水平上检测到了PAL转录达到最高峰。

诱导子对植物作用的过程中，会改变植物细胞的结构从而使细胞膜发生氧化，同时植物会产生小分子物质来增强自身的渗透调节能力。MDA是植物细胞膜氧化的产物，MDA的含量可以作为植物受诱导子胁迫后细胞结构受到影响的重要指标。脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白等是植物体内有效的渗透调节物质及营养物质，其累计可明显地提高植物细胞的渗透调节能力，使细胞在胁迫下保持正常的功能。孙际薇（2014）研究发现，200 μmol·L1的MJ处理曼陀罗的毛状根后，导致毛状根中Pro的含量显著地高于对照组。本研究同样也发现，AgNO3的添加导致毛状根中MDA、脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量的提高。可溶性糖与可溶性蛋白的渗透能力可以防治植物细胞过度脱水，保持植物细胞水分的平衡，减少诱导子对植物生长造成的影响（张红敏，2014）。另外，可溶性蛋白含量的增加，可能是诱导子的添加导致防御蛋白的合成，防御系统启动时会有大量的蛋白质合成。这些因素都提高了颠茄毛状根细胞的调节能力，从而对次级代谢产物的积累起到良好的作用。

诱导子可作为信号子被植物细胞膜上的受体识别并与其结合，结合后可以引起细胞膜及细胞内发生一系列的级联反应，合成与植物次生代谢合成相关的酶或使其酶的活性发生变化，从而使植物基因表达发生变化，导致次生代谢产物的合成与积累。而且诱导子在与植物相互作用时能选择性、快速、高度专一的诱导植物特定基因的表达，从而积累特定的次生代谢产物（翟俏丽，2011）。Peter & Sang（2003）在罂粟悬浮细胞培养的过程中添加真菌诱导子后，诱导子可显著地诱导了八种生物碱合成基因中的七个基因的转录。在本研究中，25～150 μmol·L1浓度的AgNO3处理均能显著性地刺激颠茄托品烷类生物碱合成关键基因pmt、trI、h6h的表达。表明这几个基因表达量的提高均能有效提高颠茄毛状根中托品烷类生物碱含量的积累。

本研究发现，添加AgNO3后，颠茄毛状根的生长受到了抑制，但其托品烷类生物碱的产量在50、100、150 μmol·L1处理时显著性地提高了。本研究还发现，在这三种浓度处理下，颠茄毛状根生的MDA、脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖的含量与对照相比也有显著性地提高，同时颠茄托品烷类生物碱代谢过程中关键酶基因的表达量也有显著性地提高。由此可以推测，AgNO3胁迫后，颠茄毛状根通过脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖等生理指标影响初级代谢，从而影响托品烷类生物碱生物碱的积累；同时从关键酶基因的表达影响次级代谢，从而促进了托品烷类生物碱的积累。但生理指标的改变是否会影响关键酶的表达，这个问题还有待于进一步研究。

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