吕殷婷 焦举 杨婷 邹琼 江淑琴 张勇

【摘要】目的從人前列腺癌DU145细胞中富集具有干细胞特性的肿瘤细胞，并鉴定其肿瘤干细胞特性。方法利用流式细胞仪比较人前列腺癌LNCaP细胞、DU145细胞中CD44+细胞所占比例；通过无血清连续传代培养，富集干性肿瘤细胞，计算不同时间点成球率；将无血清悬浮培养的肿瘤微球细胞，再次在含血清培养基中培养，验证肿瘤干细胞的分化特性；利用CCK8增殖试验分别检测DU145细胞和DU145肿瘤微球细胞，比较两者增殖能力的差异；分别以DU145肿瘤微球细胞、DU145细胞为实验组和对照组制备荷瘤裸鼠模型，比较两者体内成瘤能力。结果流式细胞仪检测显示CD44+LNCaP、CD44+DU145比例分别为04%、976%。无血清悬浮培养DU145细胞第2日的成球率为（144±78）%，第7日的成球率为（342±87）%，第14日的成球率高达（614±76）%。悬浮成球DU145细胞在加入含10%胎牛血清培养基24h后，表现出和常规贴壁培养DU145细胞相同形态。DU145肿瘤微球细胞在铺板后24h其增殖能力就可达到DU145细胞的2倍左右，在第6日之后，DU145肿瘤微球细胞存活率仍高于DU145细胞，组间450nm处吸光度比较差异均有统计学意义（P均<005）。与DU145细胞荷瘤裸鼠相比，DU145肿瘤微球细胞荷瘤裸鼠的移植瘤体积较大、生长速度较快（P均<005）。结论无血清连续传代培养的DU145细胞经富集分离可得到具有干细胞特征的前列腺肿瘤细胞，该方法简便易行，具有较理想的应用前景。

【关键词】前列腺肿瘤干细胞；分化群44；无血清培养；富集；鉴定

EnrichmentandidentificationofprostatecancerstemcellsfromDU145cellsLyuYinting，JiaoJu，YangTing，ZouQiong，JiangShuqin，ZhangYongDepartmentofNuclearMedicine，theThirdAffiliatedHospitalofSunYatsenUniversity，Guangzhou510630，China

Correspondingauthor，ZhangYong，Email：zy5040@163com

【Abstract】ObjectiveToenrichprostatecancerstemcellsfromhumanprostatecancerDU145celllineandidentifythecharacteristicsoftumorstemcellsMethodTheproportionofCD44+cellsinLNCaPandDU145cellswasdetectedbyflowcytometryThespheroidizationratesatdifferenttimepointswerecalculatedbyserumfreecontinuouscultureandenrichmentoftumorstemcellsThetumormicrospheresculturedintheserumfreeculturemediumweresubsequentlyculturedintheserumcontainingculturemediumtoverifythedifferentiationabilityoftumorstemcellsCCK8proliferationassaywasadoptedtomonitorandcomparetheproliferationabilitybetweenDU145cellsandDU145tumormicrospheresThetumorbearingnudemousemodelswereestablishedbyDU145cellsasthecontrolgroupandDU145tumormicrospheresastheexperimentalgroupThetumorigenicabilityinvivowasstatisticallycomparedbetweentwogroupsResultsFlowcytometrydemonstratedthattheproportionofCD44+LNCaPcellsandCD44+DU145cellswas04%and976%Afterculturedintheserumfreesuspension，thespheroidizationrateofDU145cellswas（144±78）%onthe2ndday，（342±87）%onthe7thdayand（614±76）%onthe14thday，respectivelyAfterculturedinthemediumcontaining10%fetalbovineserumfor24h，DU145tumormicrospheresshowedthesamemorphologyasDU145cellsTheproliferationabilityofDU145tumormicrosphereswasapproximatelytwiceashighasthatofDU145cellsduringthefirst24hOnthe6thday，thesurvivalrateofDU145tumormicrosphereswasstillhigherthanthatofDU145cellsTheabsorbancevaluesatthewavelengthof450nmsignificantlydifferedbetweentwogroups（allP<005）ComparedwithtumorbearingnudemousemodelsestablishedbyDU145cells，thetumorsizewassignificantlylargerandthegrowthratewasconsiderablyfasterinthemousemodelsbyDU145tumormicrospheres（bothP<005）ConclusionProstatecancerstemcellscanbeobtainedafterenrichmentandisolationbyserumfreecontinuouspassageofDU145cells，whichissimpleandfeasibleanddeservespromisingapplicationprospect

【Keywords】Prostatecancerstemcell；CD44；Serumfreeculture；Enrichment；Identification

前列腺癌是全球第二常见的男性恶性肿瘤[1]。虽然前列腺癌可以早期诊断及治疗，但仍然是全世界男性癌症死亡的第六大原因[2]。目前，针对前列腺癌治疗的方式主要有手术切除、放射治疗、内分泌治疗等几大类[3]。然而，大多数前列腺癌在去势手术治疗后2年内最终将转化为去势抵抗型前列腺癌，亦称为难治性前列腺癌（CRPC）。近年来，许多研究者提出了“前列腺肿瘤干细胞（PCSC）”的概念，认为这可能是前列腺癌的细胞起源，并在前列腺癌的发生、发展、转移、复发、去势抵抗及耐药等多个方面发挥作用[4]。肿瘤干细胞是肿瘤组织中具有无限自我更新能力并能产生肿瘤异质性的细胞，其特性还包括具有分化潜能、高致瘤性等[5]。有研究发现，从前列腺移植瘤中获取的CD44+细胞具有干细胞特性。CD44是一種细胞表面分子，在细胞黏附、信号转导、肿瘤迁移进展等多方面有重要作用，也被公认为是细胞具有干性倾向的分子标志。本研究选取人前列腺癌DU145细胞进行无血清连续传代培养，从而富集、分离肿瘤干细胞并鉴定其特性，以期利用一种简单、快捷、有效的方法实现前列腺肿瘤干细胞的制备，为后续更多针对前列腺癌干细胞靶向治疗的研究奠定基础。

材料与方法

一、材料

人前列腺癌LNCaP、DU145细胞株购自中国科学院上海细胞库。胎牛血清、RPMI1640培养基、DMEM/F12细胞培养基、磷酸盐缓冲液（PBS）购自美国Gibco公司。青霉素链霉素混合液、005%胰酶（含EDTA）、牛血清白蛋白（BSA）、胰岛素、B27购自美国Sigma公司。人重组表皮生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（bFGF）购于美国PeproTech公司。胰酶抑制剂购自索莱宝公司。超低黏附6孔培养板购自美国Corning公司。异硫氰酸荧光素（FITC）标记的鼠抗人CD44抗体及其同型抗体（IgG2b）、流式细胞仪购自美国BD公司。CCK8增殖检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。550型酶标仪购自美国Biorad公司。4～6周龄的NODSCID雄性裸鼠，体质量18～20g，购自北京维通利华公司，饲养于中山大学北校区动物实验中心SPF级动物房，实验遵循动物伦理要求。

二、方法

1细胞培养及传代

将RPMI1640培养基加入10%胎牛血清和1%青霉素链霉素混合液制备成含血清培养基（SSM）。将体积分数2%B27、04%BSA、5μg/ml胰岛素、10ng/mlbFGF、20ng/mlEGF加入DMEM/F12培养基制备成无血清培养基（SFM）。DU145细胞在SSM中培养时，每2d进行细胞换液或传代；在SFM中培养时，每日观察悬浮细胞生长情况并轻摇晃培养瓶避免细胞贴壁，每3d进行细胞换液，每7d进行细胞传代。细胞传代时，弃旧培养基，加入1ml胰酶共孵育2min后，加入2ml胰酶抑制剂（或SSM）终止消化，后继续按1∶2的比例传代培养，每日观察细胞生长情况。

2LNCaP、DU145细胞中CD44+表达情况的检测

取经SSM培养至对数生长期的LNCaP细胞和DU145细胞，分别以1×106个重悬于100μlPBS溶液中，2种细胞各制备3管，分别为空白管、同型对照管（含1μlIgG2b）、FITCCD44抗体管（含1μlFITCAntiCD44）避光4℃反应15min后，加入1mlPBS，1000转/分离心3min，轻倒掉上清液后加入400μlPBS重悬细胞，利用流式细胞仪检测CD44+细胞比例。

3DU145细胞无血清传代培养富集肿瘤干细胞及成球率的计算

取经SSM培养至对数生长期的DU145细胞，经40μm孔径细胞筛滤过，用PBS离心清洗1次以去除血清后，以3×104个/孔重新铺板于超低黏附6孔板中，加入SFM继续在37℃、5%CO2培养箱中培养14d。每日摇晃1次培养板避免细胞贴壁，每3d换1次液，分别于第20h、2d、7d、14d在倒置相差显微镜下动态观察。以形态立体、肿瘤细胞微球直径>60μm定义为成球，连续计数5个视野取平均值计算成球率。成球率=该视野内成球细胞个数/该视野内总细胞个数×100%。

4SSM和SFM中检测DU145肿瘤微球细胞的分化能力

将连续在SFM中培养14d后的DU145肿瘤微球细胞用胰酶消化分离后，用SSM终止反应，1000转/分离心3min后弃上清液，加入新鲜SSM重悬细胞，于37℃、5%CO2培养箱中培养，动态观察并记录细胞形态变化情况。收集细胞，再次用500μl胰酶消化3min后用1ml胰酶抑制剂终止反应，离心后，用新鲜SFM重悬细胞并动态观察记录细胞形态变化情况。

5DU145肿瘤微球细胞的体外增殖能力检测

分别将DU145细胞、DU145肿瘤微球细胞制备成单细胞悬液，以103个/100μl的密度在96孔板中各接种3孔，使用SSM、37℃、5%CO2培养箱中培养，每块板设置3个含100μlSSM但不含细胞的的空白孔，以后每隔2d换液1次。第1～8日，每日于同一时间给一块板加入10μlCCK8工作液后与细胞避光继续在37℃、5%CO2培养箱内培养15h后，利用酶标仪测定450nm处吸光度（OD450），并绘制细胞增殖曲线。

6检测DU145肿瘤微球细胞在免疫缺陷裸鼠体内的成瘤情况

DU145细胞（65×105/100μl）、DU145肿瘤微球细胞（65×104/100μl）分别消化、离心后以PBS重悬为上述密度单细胞悬液。将6只雄性NODSCID裸鼠称重后随机分为2组，每组3只。每只裸鼠注射100μl细胞悬液和100μl基质胶混合液于左后腿根部皮下，动态观察2组裸鼠的成瘤情况，待肉眼可见肿瘤后，每5d用游标卡尺测量肿瘤的长径和短径，计算肿瘤体积。肿瘤体积=（π×长径×短径2/6）mm3，35d后处死裸鼠，并绘制肿瘤生长曲线。

三、統计学处理

应用SPSS130处理数据。计量资料以±s表示，组间比较采用独立样本t检验。P<005为差异有统计学意义。

结果

一、LNCaP细胞、DU145细胞中CD44+细胞比例比较

CD44+LNCaP细胞、CD44+DU145细胞比例分别为04%、976%，见图1。CD44+DU145细胞比例约为CD44+LNCaP细胞的271倍。

二、DU145细胞无血清连续传代培养富集肿瘤干细胞及成球率

DU145细胞具有干细特征的部分可以在无血清培养基中生存并逐渐形成悬浮细胞球：悬浮培养20h时，单个细胞开始出芽，但尚未形成立体形态；悬浮培养第2日可观察到一小部分细胞表现出成球团的趋势，成球率为（144±78）%；第7日可观察到形态立体、典型的悬浮球形成，成球率为（342±87）%；悬浮培养第14日，成球率明显较第7日增加，满视野内可观察到立体形态的悬浮球，成球率为（614±76）%。并且DU145肿瘤微球细胞在经过无血清悬浮培养传代后，仍可形成与原细胞形态类似的次代并逐渐形成悬浮肿瘤微球细胞，见图2。

三、DU145肿瘤微球细胞的分化能力

将无血清悬浮培养的DU145肿瘤微球细胞转入含10%胎牛血清中培养10h，已能观察到细胞贴壁，24h后其伸出伪足逐渐形成单层贴壁细胞，形态与常规贴壁培养DU145相近，见图3。再次将其转入无血清悬浮培养，仍能在20h后观察到单个细胞开始出芽，形成一些悬浮细胞团，继续培养至第5日，可观察到典型肿瘤细胞球形成。

四、DU145肿瘤微球细胞的体外增殖能力

DU145肿瘤微球细胞与普通DU145细胞在铺板后第2日的OD450分别为0757±0059、0373±0068，DU145肿瘤微球细胞增殖能力达到普通DU145细胞2倍左右（t=7382，P<005）。从第6日开始，两者皆进入生长平台期。到第8日，DU145肿瘤微球细胞与普通DU145细胞的OD450分别为0228±0063、0086±0036，DU145肿瘤微球细胞存活量仍高于DU145细胞（t=3373，P<005），见图4。

五、DU145肿瘤微球细胞在免疫缺陷裸鼠体内的成瘤情况

DU145细胞组种植细胞的数量级是DU145肿瘤微球细胞组的10倍，但在移植瘤细胞接种裸鼠

图1LNCaP细胞、DU145细胞中CD44+细胞流式细胞仪检测结果

A、B：LNCaP细胞；C、D：DU145细胞

A：悬浮培养20h时，单个细胞开始出芽，但尚未形成立体形态；B：悬浮培养第2日，可观察到一小部分细胞表现出成球团的趋势；C：悬浮培养第7日，可观察到形态立体、典型的悬浮球形成；D：悬浮培养第14日，满视野内可观察到立体形态的悬浮球；标尺=60μm

细胞的体外增殖能力比较后第10日，DU145细胞组仅2只裸鼠可见皮下成瘤，瘤体体积（84±12）mm3，成瘤率2/3，而DU145肿瘤微球细胞组3只裸鼠均可见皮下肿瘤形成，瘤体体积（281±59）mm3，成瘤率为3/3，DU145肿瘤微球细胞组在第10日的瘤体体积大于DU145细胞组（t=4464，P<005）。接种后第30～35日为移植瘤快速生长期，DU145细胞组生长速度为（692±201）mm3/d，DU145肿瘤微球细胞组为（3763±451）mm3/d，DU145肿瘤微球细胞组生长速度达到DU145细胞组的5倍（t=8709，P<005），见图5A。DU145细胞与DU145肿瘤微球细胞移植瘤在裸鼠体内生长35d后活体情况见图5B、C。

A：接种DU145细胞与DU145肿瘤微球细胞在免疫缺陷裸鼠体内的移植瘤体积增长曲线；B：DU145细胞在免疫缺陷裸鼠体内35d生长情况，红色箭头为裸鼠皮下成瘤处；C：DU145肿瘤微球细胞在免疫缺陷裸鼠体内35d生长情况讨论

近年来，研究者们已在多种肿瘤中分离并证实存在肿瘤干细胞[67]。在既往关于前列腺癌治疗的相关报道中，基本是以前列腺癌细胞系为研究对象进行体内外研究。然而越来越多的研究表明，前列腺肿瘤干细胞才是前列腺癌发生、发展的根源。为此，本研究通过简单易行的无血清连续传代培养法富集、分离前列腺肿瘤干细胞，并证明了其肿瘤干细胞相关特性，以期为针对前列腺肿瘤干细胞的诊断及治疗研究奠定基础。虽然，免疫磁珠分选法和流式分选法也是为研究者们所熟知的分选、富集肿瘤干细胞的另外2种常见方法。但是，这2种方法相较于本研究所使用的无血清连续传代培养法，对科研设备要求更高，费用也较为昂贵，例如利用免疫磁珠法分选CD44+DU145细胞需要合适的磁场，以及同时制备大量的DU145细胞（108数量级）进行分选，对研究实验要求较高[8]。若利用流式分选法进行CD44+DU145细胞分选，由于流式细胞仪分选通道较长易造成细胞污染，且分选步骤复杂容易损伤细胞活性，分选得到的细胞难以用于后续实验[9]。

虽然既往研究显示，CD44分子仍表达于结肠癌、头颈部鳞癌、胃癌、膀胱癌、神经胶质瘤、鼻咽癌等肿瘤细胞[1011]。但本研究选用的是CD44+人前列腺癌DU145细胞系，研究对象为前列腺癌，并通过无血清连续传代培养的方式富集得到了具有干性特征的前列腺肿瘤细胞。因此，这与CD44不仅表达在前列腺肿瘤干细胞的特性并不冲突。

研究发现，在人前列腺癌细胞株如LNCaP、DU145及PC3中，CD44+细胞比CD44-细胞有更强的增殖及成瘤的能力。Ugolkov等[12]指出，在前列腺癌组织中CD44+细胞约占72%，这一发现颠覆了以往干细胞仅占据组织细胞很小比例的认识。本研究中，流式细胞仪检测结果示DU145细胞系中CD44+细胞约占976%，与Ugolkov等的观点相符。

综上所述，本研究通过对DU145细胞系连续传代无血清培养富集、分离得到了具有干性特征的肿瘤细胞。这对于肿瘤干细胞这一类较难获取细胞具有重要意义。同时，本研究也对前列腺癌治疗的相关研究，特别是对去势难治性前列腺癌的治疗提供了一种新的靶向治疗思路，即针对前列腺肿瘤干细胞进行靶向治疗，从根源上治疗前列腺癌。针对前列腺肿瘤干细胞的研究极具前景，本研究团队将以此研究为基础，今后继续开展针对前列腺肿瘤干细胞靶向诊断及治疗的相关研究，进而为前列腺癌的基础研究提供一定的支持或参考。

参考文献

[1]SiegelRL，MillerKD，JemalACancerstatistics，2015CACancerJClin，2015，65（1）：529

[2]JemalA，SiegelR，XuJ，WardECancerstatistics，2010CACancerJClin，2010，60（5）：277300

[3]SharifiNMechanismsofandrogenreceptoractivationincastrationresistantprostatecancerEndocrinology，2013，154（11）：40104017

[4]张波，范新兰，林天歆，许可慰，黄海，黄健PC3悬浮成球细胞中ABCG2表达及其对化学治疗耐药性的实验研究新医学，2012，43（11）：787791

[5]SampieriK，FoddeRCancerstemcellsandmetastasisSeminCancerBiol，2012，22（3）：187193

[6]LiuT，ChiH，ChenJ，ChenC，HuangY，XiH，XueJ，SiYCurcuminsuppressesproliferationandinvitroinvasionofhumanprostatecancerstemcellsbyceRNAeffectofmiR145andlncRNARORGene，2017，631：2938

[7]SteinmetzNF，MaurerJ，ShengH，BensussanA，MaricicI，KumarV，BraciakTATwodomainsofvimentinareexpressedonthesurfaceoflymphnode，boneandbrainmetastaticprostatecancerlinesalongwiththeputativestemcellmarkerproteinsCD44andCD133Cancers（Basel），2011，3（3）：28702885

[8]夭志剛，严兵，唐浩宇，张昆，武成闯，李金荣，王华科免疫磁珠法分离鉴定前列腺癌干细胞世界临床医学，2016，10（12）：13，15

[9]李奎庆，许可慰，周邦奋，范新兰，董文，张彩霞，毕良宽前列腺癌干细胞分离方法的对比及筛选中国组织工程研究，2012，16（6）：10111014

[10]杨宏琼，周志华，张尤历，徐岷，徐萍，吴莺，王银环人胃癌细胞株SGC7901的克隆形态观察及含肿瘤干细胞克隆的鉴定中华肿瘤杂志，2013，35（3）：164169

[11]WangSJ，BourguignonLYRoleofhyaluronanmediatedCD44signalinginheadandnecksquamouscellcarcinomaprogressionandchemoresistanceAmJPathol，2011，178（3）：956963

[12]UgolkovAV，EisengartLJ，LuanC，YangXJExpressionanalysisofputativestemcellmarkersinhumanbenignandmalignantprostateProstate，2011，71（1）：1825

（收稿日期：20180320）