王祁民 安静 李颖 马银玲 董占军

中图分类号 R28 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）08-1048-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.08.09

摘 要 目的：建立同时测定通关藤药材中通关藤苷A、H、I含量的方法。方法：采用超高效液相色谱-串联质谱法，色谱柱为Phenomenex Kinetex XB-C18，流动相为0.1%甲酸溶液-乙腈（梯度洗脱）， 流速为 0.2 mL/min，柱温为40 ℃，进样量为5 μL，离子源为电喷雾离子源，多反应离子监测模式，正离子扫描，离子源喷射电压为5 500 V，雾化气压力为60 psi，加热气压力为60 psi，帘气压力为20 psi，去溶剂温度为600 ℃。结果：通关藤苷A、H、I检测质量浓度线性范围分别为0.1～10 ng/mL（r=0.999 7）、0.025～10 ng/mL（r=0.999 5）、0.025～10 ng/mL（r=0.998 9）；定量限分别为0.1、0.025、0.025 ng/mL，检测险分别为0.05、0.012 5、0.012 5 ng/mL；精密度、稳定性、重复性试验的RSD均小于4.0%；加样回收率分别为97.67%～99.00%（RSD=0.47%，n=6）、95.00%～101.67%（RSD=2.59%，n=6）、96.67%～103.33%（RSD=2.83%，n=6）。结论：该方法操作简便，精密度、稳定性、重复性好，可用于通关藤药材中通关藤苷A、H、I含量的同时测定。

关键词 通关藤；通关藤苷A；通关藤苷H；通关藤苷I；超高效液相色谱-串联质谱法

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the method for simultaneous determination of tenacissoside A， tenacissoside H and tenacissoside I in Marsdenia tenacissima. METHODS： UPLC-MS/MS method was adopted. The determination was performed on a Phenomenex Kinetex XB-C18 column with mobile phase consisted of 0.1% formic acid solution-acetonitrile （gradient elution） at the flow rate of 0.2 mL/min. The column temperature was set at 40 ℃， and sample size was 5 μL. Multiple reaction monitoring （MRM） mode was adopted with electrospray ion source as ion source， using positive ion scanning. Source jet voltage was 5 500 V， nebulizer pressure was 60 psi， heating pressure was 60 psi， curtain pressure was 20 psi and cone temp was set at 600 ℃. RESULTS： The linear ranges of tenacissoside A， tenacissoside H and tenacissoside I were 0.1-10 ng/mL （r=0.999 7）， 0.025-10 ng/mL（r=0.999 5）， 0.025-10 ng/mL（r=0.998 9）， respectively； limited of quantation were 0.1，0.025，0.025 ng/mL，limited of detection were 0.05，0.012 5，0.012 5 ng/mL， respectively； RSDs of precision， stability and reproducibility tests were<4.0%. The recoveries were 97.67%-99.00%（RSD=0.47%，n=6）， 95.00%-101.67%（RSD=2.59%，n=6）， 96.67%-103.33%（RSD=2.83%，n=6）. CONCLUSIONS： The method is simple， precise， stable and reproducible， and can be used for simultaneous determination of tenacissoside A， tenacissoside H and tenacissoside I in M. tenacissima.

KEYWORDS Marsdenia tenacissima； Tenacissoside A； Tenacissoside H； Tenacissoside I； UPLC-MS/MS

通關藤[Marsdenia tenacissima（Roxb.） Wight et Arn.]又名乌骨藤、通光藤、通关散、奶浆藤等，收载于2015年版《中国药典》（一部），分布于我国云南、贵州等地，入药部位为其干燥藤茎，有止咳平喘、祛痰、通乳、清热解毒等功效[1-3]。现有文献报道多集中于通关藤药材中酚酸类物质[4-7]，近期研究显示通关藤药材主要活性成分为甾体皂苷类化合物[3]。2015年版《中国药典》（一部）中通关藤药材的含量测定项是以通关藤苷H为指标成分，采用高效液相色谱法（HPLC）进行检测的。随着对该药材研究的不断深入，鉴定分离的通关藤苷种数不断增加[2-3]，有文献报道了采用HPLC法测定通关藤药材及其制剂中通关藤苷的方法[8-10]。本试验采用超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）建立同时测定通关藤药材中通关藤苷A、H、I含量的方法，以期为更好地对该药材进行质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器

UPLC-30A型UPLC系统（日本Shimadzu公司）； AB Sciex Triple QuadTM 5500 型串聯四极杆线性离子阱MS仪（美国Sciex公司）；AB204-S型电子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；KQ3200型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

通关藤苷A对照品（山西省中医药研究院，批号：20130513，纯度：>98.3%）；通关藤苷H对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111913-201202，纯度：>98%）；通关藤苷I对照品（深圳远扬生物技术有限公司，批号：20160311，纯度：>98%）；乙腈、甲醇、甲酸为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

1.3 药材

通关藤药材 （国药乐仁堂石家庄药材有限公司，批号：160132、160320、160521，产地：云南）经河北省人民医院药学部董占军主任药师鉴定为真品。

2 方法与结果

2.1 试验条件

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Phenomenex Kinetex XB-C18（50 mm×2.1 mm， 2.6 μm）；流动相：0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～1 min，40%B；1～2 min，40%B→90%B；2～4 min，90%B；4～4.01 min，90%B→40%B；4.01～6 min，40%B）；流速：0.2 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：5 μL。

2.1.2 质谱条件 离子源：电喷雾离子源（ESI）；多反应离子监测模式（MRM），正离子扫描；离子源喷射电压：5 500 V；雾化气（gas 1）压力：60 psi；加热气（gas 2）压力：60 psi；帘气压力：20 psi；去溶剂温度：600 ℃；其余质谱分析参数见表1（表中DP为解簇电压，CE为碰撞能量）。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 精密称取待测成分对照品各适量，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，得通关藤苷A、H、I质量浓度均为1 mg/mL的单一对照品贮备液，于 4 ℃贮藏，备用。精密量取上述单一对照品贮备液各10 μL，分别置于量瓶中，加甲醇定容至1 mL，得通关藤苷A、H、I质量浓度均为10 μg/mL的单一对照品溶液。精密量取上述单一对照品溶液各适量，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇定容，得通关藤苷A、H、I质量浓度均为100 ng/mL的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 精密称取药材样品粉末（过3号筛）1.006 g，置于锥形瓶中，加甲醇40 mL，称定质量，密塞，超声（功率：120 W，频率：40 kHz）处理25 min，冷却，再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，得供试品溶液Ⅰ；精密量取上述供试品溶液Ⅰ10 μL，置于量瓶中，加甲醇稀释并定容至200 mL，经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液 缺药材样品，按“2.2.2”项下方法操作，得阴性对照溶液。

2.3 专属性试验

精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各5 μL，按“2.1”项下试验条件进样测定。结果表明，各待测成分出峰时间稳定，峰形良好，阴性对照无干扰，色谱见图1。

2.4 线性关系考察

精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液各适量，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，制成通关藤苷A、H、I质量浓度均为10、8、4、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.025 ng/mL的系列混合对照品溶液。精密量取上述系列混合对照品溶液各5 μL，按“2.1”项下试验条件进样测定，记录峰面积。以通关藤苷A、H、I质量浓度（x，ng/mL）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归。回归方程与线性范围见表2。

2.5 定量限与检测限考察

精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，倍比稀释，并按“2.1”项下试验条件进样测定，当信噪比为10 ∶ 1时，得定量限；当信噪比为3 ∶ 1时，得检测限，详见表2。

2.6 精密度试验

取“2.4”项下质量浓度为1 ng/mL混合对照品溶液适量， 按“2.1”项下试验条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，通关藤苷 A、H、I峰面积的RSD分别为2.46%、1.53%、3.22%（n=6），表明日内精密度良好。按“2.1”项下试验条件连续测定3 d，记录峰面积。结果，通关藤苷 A、H、I峰面积的RSD分别为3.26%、2.67%、3.81%（n=6），表明日间精密度良好。

2.7 稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液（批号：160132）适量，分别于室温下放置0、2、4、8、12、24 h时按“2.1”项下试验条件进样测定，记录峰面积。结果，通关藤苷A、H、I峰面积的RSD分别为3.83%、1.51%、2.85%（n=6），表明供试品溶液室温放置24 h内基本稳定。

2.8 重复性试验

精密称取药材样品（批号：160132）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，共6份，再按“2.1”项下试验条件进样测定，记录峰面积并计算含量。结果，通关藤苷A、H、I含量平均值分别为6.35、1.27、0.62 mg/g，RSD分别为 3.16%、3.74%、2.71%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验

取已知含量样品（批号：160132）适量，每份0.5 g，共6份，分别加入一定质量的待测成分对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下试验条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表3。

2.10 耐用性试验

2.10.1 色谱柱考察 取药材药品（批号：160132）质量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下试验条件[色谱柱分别为Phenomenex Kinetex XB-C18（50 mm×2.1 mm，2.6 μm）、Accucore C18（50 mm×2.1 mm，2.6 μm）、 Cosmocore C18（50 mm×2.1 mm， 2.6 μm）]进样测定，记录峰面积并计算样品含量，详见表4。结果表明，本试验条件在一定色谱柱变动情况下耐用。

2.10.2 流动相考察 取药材药品（批号：160132）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下试验条件（流动相中甲酸溶液体积分数分别为0.05%、0.15%、0.20%）进样测定，记录峰面积并计算样品含量，详见表4。结果表明，本试验条件在一定流动相变动情况下耐用。

2.10.3 流速考察 取药材药品（批号：160132）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下试验条件（流速分别为0.15、0.20、0.25 mL/min ）进样测定，记录峰面积并计算样品含量，详见表4。结果表明，本试验条件在一定流速变动情况下耐用。

2.10.4 柱温考察 取药材药品（批号：160132）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下试验条件（柱温别为25、30、35 ℃）进样测定，记录峰面积并计算样品含量，详见表4。结果表明，本试验条件在一定柱温变动情况下耐用。

2.11 药材样品含量测定

取3批药材样品各适量，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下试验条件进样测定，平行测定3次，记录峰面积并计算药材样品含量，结果见表5。

3 讨论

通关藤药材及其制剂在临床上应用日益广泛，但缺乏其质量控制的相关标准，通关藤药材含多种成分，包括酚酸类、C21甾体皂苷类、甾醇/环醇类、多糖类、三萜类化合物等[3]。以前文献多报道其酚酸类成分[4-7]，但酚酸类物质存在于多种中药材中，特异性不强；近年研究显示，C21甾体皂苷是通关藤的主要活性成分，目前从通关藤药材中提取的通关藤苷就超过50种[11-12]。因此，有必要建立以多种通关藤苷含量为指标的质量控制标准，本研究在2015年版《中国药典》（一部）基础上，又选择了含量较高的通关藤苷A和I[9-10]作为检测指标。

通关藤苷A、I属于甾体皂苷类，是一类苷元为孕甾烷衍生物与2-脱氧糖等形成的苷，在紫外光谱末端有吸收，因此多数文献[8-10]报道采用 HPLC法对甾体皂苷类进行测定，但是采用末端吸收波长会受到较大干扰；且由于通关藤苷H没有紫外吸收，所以不能和其他成分同时检测。另一方面，中药成分复杂，采用HPLC法分析干扰较大，为达到合格的分离度，往往分析时间很长（>0.5 h）。本研究采用UPLC-MS/MS技术，MRM模式，通过对色谱条件及质谱条件的优化，6 min内完成了对通关藤苷A、H、I的同时测定，操作简便，精密度、稳定性、重复性好，为通关藤药材的质量控制提供了一定供鉴。

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（收稿日期：2017-07-05 修回日期：2017-09-12）

（编辑：张 静）