张 霞 ，秦彩艳 ，霍海龙 ，王淑燕 ，王 配 ，潘伟荣 ，张永云 ，陈园园 ，霍金龙

（1.云南农业大学云南省版纳微型猪近交系重点实验室，昆明 650201；2.云南农业大学动物科学技术学院，昆明 650201；3.云南农业职业技术学院教务处，昆明 650031；4.云南农业大学农科专业基础实验教学示范中心，昆明 650201）

器官移植在临床医学中始终面临诸如供体器官严重不足的问题，制约了器官移植的广泛应用。因此异种器官移植被认为是解决供体器官短缺的有效途径，作为拯救和延续人类生命的一种重要手段，广受医学工作者和科研工作者的关注。目前猪已被认为是异种器官移植重要的候选物种[1-2]，但是异种移植后将出现比同种移植更为复杂的排斥反应，其中，超急性排斥反应（Hyperacute rejection，HAR）是异种器官移植需要克服的主要屏障。它在异种器官移植免疫排斥反应中发生最快、破坏力最大[3-4]。而版纳微型猪近交系是世界上首个培育成功的猪近交系，其基因高度纯合、遗传背景清楚，生理生化、解剖和疾病发生等方面与人类极为相似，可为新药临床应用前的安全性评价、猪基因组计划中的功能基因研究、人类疾病动物模型的制作和人类异种器官移植等众多领域提供良好的实验素材和器官供体，具有重要的科研价值和科学应用前景[5-7]。

引起猪→灵长类动物异种器官移植HAR的主要原因是猪器官内皮细胞表面的α-1,3-半乳糖（α-1,3-Gal）抗原，被受体的抗体识别并激活补体级联瀑布效应，从而引发超急性排斥反应[8-10]。将敲除α-1,3半乳糖基转移酶（α-1,3galactosyltransferase，GGTA1，α-1,3GT）的猪的器官移植到受体后，受体的补体活性及细胞毒性作用虽明显减弱，但是并没有完全消除，提示人们除了α-1,3-Gal外可能还有其他成分在异种器官移植免疫排斥中起作用[11-14]。N-羟乙酰神经氨酸（Neu5Gc）是常见的唾液酸类型，参与免疫应答、炎症和肿瘤细胞转移等过程，是新近发现的调控猪到人异种器官移植免疫排斥反应的重要异种抗原[15-17]，当发生免疫反应时，Neu5Gc能被HD抗体（Hanganutziu-Deicher）识别，引发炎症[18-19]。然而猪体内的Neu5Gc是由CMAH催化N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）而生成，CMAH属于胞苷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶家族，是催化Neu5Gc合成的关键酶[20]。CMPNeu5Ac羟化酶是Rieske超家族很重要的成员，是从N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）合成N-羟乙酰神经氨酸（Neu5Gc）的关键酶，其中Neu5Gc和Neu5Ac被认为是唾液酸细胞表面糖类家族的成员。而且除人类以外的所有哺乳动物在其细胞表面都具有Neu5Gc突变体[21]。有研究者应用CRISPR/Cas9技术在猪胎儿成纤维细胞（PFFs）中同时靶向敲除GGTA1和CMAH基因，以此为实验材料进行实验，发现与来自GGTA1敲除猪的细胞相比，来自GGTA1/CMAH双基因敲除猪的细胞中，人类的抗体结合及抗体介导的补体依赖性细胞毒性显著降低，这表明双基因敲除猪在异种移植过程中降低免疫排斥反应有更好的优势[22]。

本研究以版纳微型猪近交系为试验材料，克隆猪CMAH基因的CDS全序列，分析其核酸和蛋白序列特征，利用生物信息学和比较基因组学对CMAH蛋白质进行功能分析；采用荧光定量PCR技术分析其在BMI 27个不同组织中的mRNA表达，采用Western blot技术检测BMI 9个组织中的CMAH蛋白表达特征，通过生物信息学分析其蛋白质的结构，为CMAH基因在异种器官移植排斥反应的功能研究提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

屠宰BMI成年公猪3头，分别采集免疫组织（肝、脾、脊髓、淋巴结、扁桃体、颌下腺、舌下腺），性腺及副性腺组织（附睾、睾丸、精囊腺），消化组织（胃、盲肠、结肠、直肠、空肠、回肠），重要的内分泌组织（甲状腺、肾上腺）以及其他普通组织（心、肺、肾、肌肉、舌头、下丘脑、大脑、小脑、皮肤）共27种样品，用于RNA水平和蛋白水平的实验研究。购买宝生物公司的高保真聚合酶ExTaq、荧光定量染料SYBR GreenⅡ，ABI公司的抗体以及碧云天公司的蛋白浓度检测试剂盒等。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取和引物设计

提取组织总RNA，经电泳和分光光度计检测质量较好的反转录为cDNA。下载猪的CMAH完整CDS序列（登录号：NM_001113015）以及猪CMAH部分mRNA序列（登录号：Y15010），利用Oligo 7软件设计F1/R1特异引物（F1：ATGAGCAGCATCGAAC AAAC，R1：TTCATGTTGTTGGGCACC）来扩增CMAH基因编码区序列1 774 bp，设计F2/R2特异引物（F2：GATGATTGAGACAGATGAGGAC，R2：GAGCAGAC CATTCTTTACCA）扩增169 bp，荧光定量分析多组织表达谱。

1.2.2 RT-PCR分离CMAH基因mRNA

35.75 μL 灭菌水，5 μL 10×GC BufferⅠ（含 Mg2+），4 μL dNTP Mixture，3 μL 睾丸 cDNA 模板，各 1 μL 10 μmol/L 上、下游引物，0.25 μL Ex TaqE，退火温度为60℃。将产物进行电泳，回收，测序。

1.2.3 多组织表达分析

分别用目的基因和内参基因的荧光定量引物制作标准曲线，以200 ng/μL起始浓度的淋巴结cDNA，进行5倍倍比连续稀释获得7个浓度梯度的模板，筛选合适的模板浓度，再进行多组织qPCR检测。

1.2.4 CMAH蛋白Western Blot分析

选取BMI肝脏、脾脏、脊髓、淋巴结、回肠、大脑、皮肤、睾丸及扁桃体9种固有免疫系统占主导的器官组织提取蛋白进行Western Blot实验，以βtubulin（54 kD）为内参蛋白。通过提取组织蛋白、BCA法测定蛋白浓度、变性、SDS-PAGE电泳、转膜、封闭、曝光、洗胶片等过程获得结果。

1.2.5 序列确定和数据分析

利用DNAStar软件进行序列组装、CDS预测、蛋白序列推导及预测蛋白质的分子量（Mw）和等电点（pI）。统计27个组织的荧光定量数据结果，采用2-ΔΔCt处理数据，分析多组织mRNA相对表达水平。使用NCBI数据库中Blast程序及ESpript网站进行多物种间氨基酸序列比较分析。利用Ensemble数据库、ProtParamtool、SOPMA、ProtScale、Prosite、TMHMM2.0、SignaIP4.1等程序分别推测基因结构、预测蛋白质的保守结构域、二级结构、疏水性、活性位点、跨膜结构、信号肽。

2 结果与分析

2.1RT-PCR扩增CMAH基因结果

对CMAH基因进行扩增，长度为1 774 bp，经2%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，片段大小与预期结果一致。

图1 CMAH的电泳结果Figure1 Electrophoresis result of CMAH

2.2 CMAH基因核酸及氨基酸序列

扩增出的版纳微型猪近交系CMAH基因CDS为1 734 bp，包含577个氨基酸，GenBank中核酸和氨基酸登录号分别为KM098147和AIS36193。下划线标出的第6～112 AA和135～252 AA位氨基酸分别属于Rieske和UlaG超家族，见图2。

2.3 CMAH基因组、mRNA和蛋白结构分析

通过Ensembl数据库搜索CMAH基因组DNA，发现该基因位于猪7号染色体NC_010449.5的21032289-21109183位置，其全长76 894 bp，包含15个外显子和14个内含子，绘制的CMAH基因组、mRNA和蛋白结构见图3。

2.4 多组织荧光定量表达分析

以脊髓组织作为中度表达的组织，采用2-ΔΔCt法分析各组织中的相对表达水平绘制出柱状图，结果表明BMI CMAH mRNA在颌下腺、脾、舌下腺等组织中高度表达，均极显著高于其他组织（P＜0.01）；在淋巴结、肝、回肠、扁桃体和肺等组织中中度表达（由高到低）；在睾丸、空肠、脊髓、结肠、直肠、盲肠、胃和肾等组织中低度表达（由高到低）；在肾上腺、精囊腺、小脑、甲状腺、皮肤、下丘脑、附睾、大脑、心、舌头和肌肉等组织中表达极弱（由高到低），见图4。

图2 BMI CMAH基因核酸序列与基酸序列Figure2 BMI CMAH gene nucleic acid sequence and amino acid sequence

图3 BMI CMAH基因组结构Figure3 Genomic structure of BMI CMAH gene

2.5 Western blot分析

采用以β-tubulin为内参的Western Blot分析CMAH蛋白在肝脏、脾脏、脊髓、淋巴结、回肠、大脑、皮肤、睾丸及扁桃体9种固有免疫系统占主导的器官组织。如图5所示，BMI CMAH蛋白在脊髓和大脑中没有表达，其他组织中均有表达。

2.6 CMAH蛋白质一级结构、二级结构和氨基酸序列信息

CMAH含有577个氨基酸，分子量66.63 kD，等电点6.37，正、负电荷残基分别有77个和72个，分子式 C3023H4641N797O853S26，不稳定系数 43.27，平均疏水性-0.441，脂肪系数82.08。有32.58%的无规则卷曲结构（188 AA），31.37%的α-螺旋结构（181 AA），22.88%的延伸链结构（132 AA），13.17%的β-转角结构（76 AA）。其N末端亲水，C末端疏水，最大疏水值1.589（第14 AA位），最小疏水值-3.011（第506和507 AA位）；存在1个亮氨酸富集的核输出信号（23-26 AA）；存在N端信号肽序列，剪切位点在蛋白质35～36 AA处；不存在跨膜螺旋结构；不含有信号肽序列；含有N-糖基化位点、N-酰基化位点及4类磷酸化位点。

图4 BMI CMAH基因的相对表达水平Figure4 Relative expression levels of BMI CMAH gene

图 5BMI CMAH蛋白在不同组织中的表达结果Figure5 The protein levels of BMI CMAH in different tissues

2.7 CMAH蛋白质序列多物种相似度计算及系统进化分析

将BMICMAH的蛋白质序列与牛Bos taurus（XP_617171）、黑猩猩 Pan troglodytes（NP_001009041）、小鼠Mus musculus（NP_001104580）和大鼠 Rattus norvegicus（NP_001019444）等5个物种的蛋白质序列导入MegAlign计算相似度，相似度分别为：93.9%、92.9%、89.4%、89.1%。之后将这5条序列导入MEGA7构建系统进化树，见图6。

图6 5个物种CMAH蛋白质序列构建的系统进化树Figure6 The phylogenetic tree CMAH protein sequences of 5 species

3 讨论

目前，猪已被科学界公认为是最合适的器官移植供体[1-2]。关于猪到非人灵长类异种器官移植的临床试验方面，目前主要集中在探索心脏和肾脏器官的移植。在基于动物异种移植的背景下，N-羟乙酰神经氨酸的表达引发炎症并促成延迟的组织排斥[23-24]。目前，N-羟乙酰神经氨酸已经在猪的心脏，肾脏，肝脏，胰腺等多数组织中被发现其阻碍异种移植的应用[25-26]。有研究显示，敲除基因CMAH的小鼠，会缺乏N-羟乙酰神经氨酸，表明CMAH是唯一可以合成N-羟乙酰神经氨酸的基因[27]。因此研究CMAH基因的基本特征以及表达情况的分析，对将来研究其分子机理起着很重要的作用。

本研究通过基因组结构分析表明该基因位于猪7号染色体，含15个外显子和14个内含子。实时荧光定量多组织表达谱分析表明BMI CMAH mRNA在颌下腺、脾和舌下腺组织中表达最高，且极显著高于其他组织，腺体和脾是重要的免疫器官，证明CMAH基因确实与免疫相关。Song K.H.等[20]的研究表明，猪CMAH外显子1～3在小肠中最高表达，在直肠、舌头、脾、睾丸、肝脏和结肠中中度表达。我们的研究结果中该基因在颌下腺、脾和舌下腺中表达最高，在淋巴结、肝、回肠、扁桃体和肺等组织中中度表达；在睾丸、空肠、结肠、直肠和肾等组织中表达较低，在舌头组织中几乎不表达。与Song K.H.等[20]的研究结果存在一定差异，这可能与品种差异等因素有关，需要进一步的探索和验证。此外本试验中Western blot结果表明CMAH蛋白在皮肤组织中表达，但皮肤组织mRNA水平检测不到CMAH基因，造成这种结果的原因可能是该基因在转录过程以及转录后翻译为蛋白质过程中的表达量有所不同，具体机制还有待进一步研究。在此研究结果的基础上，可对该基因在体外和体内的亚细胞定位研究提供基础资料，也为临床试验研究的发展奠定基础。

BMI CMAH蛋白含有Rieske和UlaG两个超家族结构域。在Rieske非血红素铁加氧酶系统以及植物的叶绿体b6f和线粒体细胞色素bc复合物中常见的[2Fe-2S]簇结合结构域中，Rieske超家族结构域包含两个亚结构域，一端是不完整的反向平行β-桶状结构，另一端是铁硫结合结构域。Rieske的铁硫中心含有一个参与电子转移的[2Fe-2S]簇，并被连接成两个组氨酸和两个存在保守序列中的半胱氨酸残基（被称为Rieske基序）[28]。在反渗透系统中，α亚基N-末端的Rieske结构域充当电子，通过穿梭接受来自还原酶或铁氧还蛋白组分的电子，并将其转移至α亚基C-末端结构域中的单核铁以用于催化。L-抗坏血酸代谢蛋白UlaG，是β-内酰胺酶超家族重要的一员，是负责碳水化合物的运输和新陈代谢的结构域。β-内酰胺酶超家族除了β-内酰胺酶之外，其他蛋白质都含有该结构域，包括硫醇酯酶，乙二醛酶Ⅱ家族的成员，其催化乳酰谷胱甘肽的水解以形成谷胱甘肽和乳酸，并且可能由参与转运的转运蛋白DNA摄取[29-30]。

蛋白质翻译后修饰对于调控蛋白的结构和功能具有重要作用，对其进行深入的鉴定和分析可以使人们对于机体内的生理和病理发生过程机制有更加深入的了解。CMAH蛋白含有磷酸化、糖基化、酰基化三大类功能位点，蛋白质磷酸化过程是很重要的调节机制，包括转录、翻译、细胞分化和发育，细胞增殖凋亡等[31]。乙酰化过程一般是通过代谢酶进而调节新陈代谢通路的。糖基化在复杂的生物学过程中也发挥着重要作用，如细胞通信、信号转导等，CMAH在催化合成NeuGc的过程中，这些修饰位点起着很重要的作用。通过计算，发现5个物种的相似性均在80%以上。构建的系统进化树显示，BMI与牛聚为一类，大鼠与小鼠聚为一类，均符合物种的系统分类学标准，而且分支节点支持率数值较高，表明该基因比较保守。

综上所述，本研究对CMAH的基因水平，mRNA水平以及蛋白水平进行了实验研究，并确定了其核酸序列和氨基酸序列，确定了其组织表达特征，对其编码的蛋白质进行了功能生物信息学分析，为后续对其在免疫排斥方面的功能验证奠定了基础，也将为进一步研究该基因所在的重要信号通路以及分子机制提供科学依据。