沙焕臣，雷建军，王 铮，段万星，徐勤鸿，黎 韡，韩 亮，马清涌，张 东

(西安交通大学第一附属医院肝胆外科，陕西西安 710061)

4-甲基亚硝氨基-3-吡啶-1-丁酮(NNK)是一种较强的致癌物质，能够诱导K-Ras突变及P53的失活，而这两种基因的突变在肺癌及胰腺癌中非常普遍[1-2]。有研究显示，NNK调控肿瘤微环境中的多种过程，与β肾上腺素受体相关[3-5]，NNK可高效并特异地结合β2肾上腺素能受体(β2受体)，并激活其下游信号通路，促进胰腺癌的进展；其下游通路可能通过缺氧诱导因子1α(HIF-1α)来诱导胰腺癌细胞的增殖及侵袭。在本研究中，我们以胰腺癌细胞株MIA PaCa-2和BxPC-3作为受试细胞，研究NNK诱导胰腺癌细胞的具体机制，并揭示β2肾上腺素受体可能通过HIF-1α来介导NNK诱导的胰腺癌细胞增殖及侵袭。

1 材料与方法

1.1材料MIA PaCa-2和BxPC-3人胰腺癌细胞株购自中国科学院上海生命研究所。DMEM细胞培养基、胰蛋白酶购自Hyclone公司，胎牛血清购自杭州四季青公司。HIF-1α、VEGF和Cyclin D1抗体均购自Bioworld公司。β-actin抗体、HRP标记山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG二抗均购自北京中杉金桥公司。聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)、Transwell小室均购自Milliproe公司。HIF-1α shRNA和对照shRNA Control质粒购自上海吉玛公司，HIF-1α shRNA的有效序列是5′-CCACCACUGAUGAAUUAAATT-3′。转染试剂Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司。Real-time PCR试剂盒购自大连TaKaRa公司。实验分组：正常对照组(Control)，对照shRNA干扰组(sh-control)，HIF-1α shRNA干扰组(sh-HIF-1α)，NNK干预组(NNK)，NNK+对照shRNA干扰组(NNK+sh-control)，NNK+HIF-1α shRNA干扰组(NNK+sh-HIF-1α)，NNK+ICI 118551干预组(NNK+ICI 118551)，CoCl2+NNK+ ICI 118551干预组(CoCl2+NNK+ ICI 118551)。

1.2细胞培养与转染人胰腺癌细胞株MIA PaCa-2和BxPC-3于含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养液中，37 ℃ 50 mL/L CO2培养箱中培养。取对数生长期的细胞进行实验。参照Lipofectamine2000转染试剂盒，瞬时转染48 h后消化细胞，按1∶6接种于6孔板后加600 μg/mL G418进行转染筛选，每2～3 d换液1次。……