王欣言

（中源协和生物细胞存储服务（天津）有限公司，天津，300384）

CIK细胞是将人外周血单个核细胞（PBMC）在体外用多种细胞因子共同培养一段时间后获得的一群异质性细胞。该种细胞同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子，故又被称为NK细胞样T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点，具有增殖能力强、杀瘤活性高、杀瘤普广等特点，被认为是新一代抗肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。［1］本实验从正常志愿者外周血分离单个核细胞诱导CIK细胞，研究其在体外的增值规律、细胞表型变化以及杀瘤活性。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

BPMI-1640培养基和胎牛血清购于以色列BI公司，IL-2、IFN购自厦门特宝生物股份有限公司，淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品有限公司CD3mAb细胞因子购自Biolegend公司，CD3-FITC、CD8-PE、CD56-PE、IgG1-PE、IgG1-FITC以 及 流式细胞仪分别购自美国BD公司，K562为本实验室保存和传代培养。

1.2 PBMC细胞的分离培养和诱导

取正常志愿者外周血100mL加入生理盐水1∶1稀释后用吸管将血液混合物沿管壁缓慢地加入Ficoll淋巴细胞分离液之上，于500g、19℃，离心23min。用吸管小心吸取第二层白色云雾状的单个核细胞层于离心管内，加入生理盐水于300g、19℃、离心5min洗涤2次后调整细胞浓度1.0×106/mL。接种于提前包被好CD3单抗的T175培养瓶，加入血清、IL-2、IFN-γ放置于37℃，5%的CO2细胞培养箱中。隔天补加培养基、血清、IL-2，观察细胞状态，计数。

1.3 CIK细胞表型检测

分别取诱导前的单个核细胞和培养至第13天CIK细胞1×106，离心去上清，用600μL PBS重悬。每次6只流式管，每只流式管内加入100μL细胞悬液分别标记带荧光的单克隆抗体（CD3-FITC）+（IgG1-PE）、（CD8-PE）+（IgG1-FITC）、（CD56-PE）+（IgG1-FITC）、（CD3-FITC）+（CD56-PE）、（CD3-FITC）+（CD8-PE）、（IgG1-FITC）+（IgG1-PE）为阴性对照，室温避光20min后PBS离心洗涤，每管加入200μLPBS重悬，上机检测。

1.4 杀瘤活性检测

取对数生长期的K562肿瘤细胞，用DMEM培养基调整细胞密度5×104/mL，加于96孔板，每孔加100μL。取培养至13天的CIK细胞，用完全培养基调整细胞密度，使效靶比分别为5∶1、10∶1、20∶1，每孔加100μL，每组取3复孔，此为实验组。另设空白对照组、效应细胞对照组、靶细胞对照组，至于37℃，5%CO2培养箱，培养24h。取出后加入20μL CCK-8孵育4h后用酶标仪450nm检测OD值，参比波长620nm，测3次取平均值。杀瘤活性=[1-（实验组-效应对照组）/（靶细胞对照组-空白对照组）]×100%

2 结果与讨论

2.1 细胞增值情况

悬浮的单个核细胞均匀分布于培养瓶中，细胞明亮，边缘规则成圆形。在细胞因子的诱导下，细胞成集落生长，细胞团快速复制增殖如图1所示，细胞数见表1。由表1可见，细胞增殖较快，呈对数增殖，16天达到增殖高峰。

表1 CIK细胞体外增殖情况

表2 CIK细胞的表型分析（ ±s）

表2 CIK细胞的表型分析（ ±s）

组别 CD3+ CD8+ CD56+ CD3++CD8+ CD3++CD56+PBMC 67.23±3.31 43.61±5.20 22.34±3.30 31.25±0.23 8.85±1.04 CIK 99.00±4.00 73.57±2.42 24.35±3.29 89.28±0.19 21.73±0.90

图1 成集落生长的CIK细胞

2.2 CIK细胞表型检测

从表2中可以看出，诱导培养16天后的CIK主要效应细胞CD3++CD56+双阳性细胞比例与未经诱导的PBMC细胞大幅上升（P＜0.05）。

2.3 CIK细胞的杀瘤活性

如表3，培养至13天时，CIK细胞对K562细胞的杀伤活性随着效靶比的增大而逐渐增强（P＜0.05）。

表3 CIK细胞的杀瘤活性

3 讨论

恶性肿瘤是一类严重危险人类健康的常见病，发病几乎可以遍及人体的各个部位、组织、器官。手术、放疗、化疗等传统治疗恶性肿瘤的方法很难从根本上完全治愈肿瘤。随着生物技术的迅速发展和对肿瘤发生分子机制的深入研究，生物治疗已经成为肿瘤综合治疗的第四种模式。虽然现在该治疗模式尚不能替代三大传统手段，仍然处于辅助治疗地位，但其在提高手术、放化疗疗效以及延长患者生存期、改善生活质量方面已经受到了越来越多的关注[2]。

CIK细胞是将人外周血或人脐带血单个核细胞在体外用多种细胞因子如IFN-γ、IL-2和CD3单抗等诱导而得到的一群异质细胞。增殖速度快，在16天左右达到增殖高峰，之后增殖速度明显下降，细胞数量开始进入平台期。CIK细胞是以CD3++CD56+T细胞为主要的效应细胞，经过细胞因子诱导后培养至16天，流式表型分析发现，CD3++CD56+双阳性细胞比例与未经诱导的PBMC细胞相比大幅上升。培养至16天的CIK细胞杀瘤活性强，其杀瘤活性随着效靶比的增加而增强。目前的研究CIK细胞主要通过3种途径发挥杀瘤、溶瘤作用：（1）CIK细胞通过释放颗粒酶／穿孔酶等毒性颗粒，导致肿瘤细胞的裂解；（2）CIK细胞释放的大量细胞因子（如干扰素γ、肿瘤坏死因子α、IL-2等）不仅对肿瘤细胞有直接抑制作用，还可通过调节机体免疫系统反应性直接杀伤肿瘤细胞；（3）CIK细胞能够诱导肿瘤细胞的凋亡。CIK细胞表FasL(Ⅱ型跨膜糖蛋白)，通过与肿瘤细胞膜表达的Fas（Ⅰ型跨膜糖蛋白）结合，诱导肿瘤细胞凋亡[3]。

CIK细胞的发现将细胞免疫治疗推上了一个新的高点。CIK细胞对肿瘤的强细胞毒性和低毒副作用，为恶性肿瘤的治疗提供了新的手段，但在CIK细胞治疗的发展过程中，还有很多问题亟待解决。寻求提高CIK细胞治疗效果的有效方法，依然是目前研究的关注点；此外，CIK细胞的抗肿瘤机制尚未完全明确，治疗方法也需要统一的规范。