杨浩宇

（长安大学材料学院高分子材料与工程系，陕西西安 710021）

皮肤是人体最大的器官，在抵御病原微生物入侵、维持内环境稳态方面具有重要的作用。当皮肤损伤时，伤口敷料能够起到维持创面湿润环境、预防感染和防止二次伤害等作用[1]，进而加快皮肤愈合，改善愈合质量。当伤口较大，甚至损伤大血管时，患者出血量较大，严重时会导致患者死亡。在此背景下，开发具备止血促凝功能的新型伤口敷料具有显著的医疗和经济价值。

大豆分离蛋白是一种从天然大豆中提取出的球型蛋白质，具有储量丰富、价格低廉、对环境无污染等优势，近年来在人造塑料、药物载体、包装材料等领域得到了较为广泛的应用[2]。与此同时，大豆分离蛋白还具有良好的细胞相容性、血液相容性和低免疫原性，在组织工程方面具有一定的应用潜力[3]。陈云等制备了一种戊二醛交联的羟乙基纤维素/大豆分离蛋白复合膜，并在促进伤口愈合方面取得了一定的效果[4]。

γ-聚谷氨酸是经由芽孢杆菌发酵制备的一种高分子聚合物，具有极佳的亲水保湿性能，并且可在生物体内溶菌酶的作用下降解[5]。γ-聚谷氨酸具有一定的生物活性，其降解产物谷氨酸可被细胞膜表面谷氨酸受体识别。此外，γ-聚谷氨酸还具有良好的止血促凝的效果[6]。将γ-聚谷氨酸混入大豆分离蛋白中，可能赋予大豆分离蛋白膜新的特性。

在前期的工作中，笔者制备了大豆分离蛋白/γ-聚谷氨酸物理共混膜。该物理共混膜遇水极易溶解。为了进一步增强复合膜的耐水性能，采用乙二醇二缩水甘油醚对两种组分进行了交联，所获得的大豆分离蛋白/γ-聚谷氨酸的耐水性和力学强度可以得到显著的提升[7]。

在本次研究中，以大豆分离蛋白和γ-聚谷氨酸为主要原料，乙二醇二缩水甘油醚为交联剂，通过溶液干燥法制备了大豆分离蛋白/γ-聚谷氨酸复合止血膜。通过扫描电子显微镜对复合止血膜的微观结构进行了观察，采用MTT实验和血浆抗凝实验对复合止血膜的细胞相容性和促凝血作用进行了评价。希望该大豆分离蛋白/γ-聚谷氨酸复合止血膜具有良好的细胞相容性和止血促凝效果，并能作为新型伤口敷料应用于皮肤组织工程领域。

1 实验部分

1.1 仪器与设备

大豆分离蛋白：蛋白干基＞90%（亿鑫生物科技有限公司）；γ-聚谷氨酸：含量＞99%（福瑞达生物科技有限公司）；乙二醇二缩水甘油醚：AR（常州市润翔化工有限公司）；乙醇：AR（江西同盟试剂化工厂）；氢氧化钠：GR（天津科密欧化学试剂有限公司）；冰醋酸：AR（天津科密欧化学试剂有限公司）；85-2型机械搅拌机：金坛市新航仪器厂；LGJ-18型大容量冷冻离心机：北京华瑞科学器材。

1.2 样品的制备

将10g大豆分离蛋白分散在60g去离子水中，然后加入30g5%氢氧化钠溶液，充分搅拌得到质量分数为10%大豆分离蛋白溶液。将3gγ-聚谷氨酸溶解在97g去离子水中，达到质量分数为3%的γ-聚谷氨酸溶液。将上述的两种溶液混合，其中大豆分离蛋白与γ-聚谷氨酸的质量比为2:1。向上述的共混溶液中加入占总溶质干重50%的乙二醇二缩水甘油醚，继续机械搅拌10min。将溶液转移到离心管中，3000r/min离心15min脱气泡，将溶液倒入平皿中，溶液的厚度为5mm。溶液自然晾干后揭膜，浸入5%醋酸溶液中30min中和氢氧化钠，然后流水冲洗48h，再次晾干得到大豆分离蛋白/γ-聚谷氨酸复合止血膜。

1.3 扫描电子显微镜观察

将复合止血膜材料经过液氮冷冻10 min，低温淬断，随后真空干燥4 h，将样品的断面贴于铜台表面并离子溅射仪喷金镀膜。在20 kV冷场加速电压下，观察复合膜表面和断面的形态。

1.4 MTT实验

将膜材料粉碎，高压灭菌20 min，烘干备用。按照“样品质量（g）/浸提介质（mL）=0.2 g/mL”的比例，称取材料样品1 g，加入5 mL的RPMI1640培养基，置于恒温培养箱中于37 ℃环境下72h。随后1000 r/min离心10 min，提取上清液作为浸提液。消化L929细胞，以浓度为1×103cells/mL的细胞悬液接种到96孔培养板中。设置阴性对照组以及空白对照组，然后置于37 ℃，5% CO2下培养箱中孵化24h。随后弃去原培养液，加入无菌PBS漂洗；加入培养基并在实验组加入50 µL样品浸提液，阴性对照组依旧加入等量完全培养基；继续在37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h、48 h、72 h。随后以20 µL/孔的比例往96孔细胞培养板中加入浓度为5 mg/mL的噻唑蓝（MTT）溶液并在37 ℃下继续培养4 h；然后小心弃去培养液，每孔加入150 µL二甲基亚砜（DMSO），震荡几分钟后用酶标仪检测在495 nm处各孔的吸光光度值（OD）。

1.5 血浆抗凝实验

收集新鲜兔血，并立即与3.8%柠檬酸三钠溶液按9∶1的比例混合均匀。将上述的全血于3000r/min离心15min，收集上清得到乏血小板血浆。将复合膜材料剪成1 mm×1mm片状，烘干备用。活化部分凝血活酶时间试剂盒购于南京建成试剂有限公司，检测过程参照商业试剂盒说明书进行。

2 结果与讨论

2.1 大豆分离蛋白/γ-聚谷氨酸复合止血膜的微观结构

复合止血膜材料的微观形貌通过扫描电子显微镜（SEM）观察得到。如图1所示，复合膜材料的表面和断面均较为光滑，并无微相分离现象发生，提示大豆分离蛋白分子和γ-聚谷氨酸分子之间具有良好的亲和性。这种现象可部分归因于乙二醇二缩水甘油醚的交联作用。在交联剂的作用下，组分高分子之间形成了广泛的化学交联和氢键交联，有助于提高复合膜的稳定性、耐水性和力学强度。

图1 大豆分离蛋白/γ-聚谷氨酸复合止血膜的表面和断面结构

2.2 大豆分离蛋白/γ-聚谷氨酸复合止血膜的细胞相容性

小鼠成纤维细胞系（L929）可模拟动物皮肤细胞，广泛用于评价止血材料的细胞相容性。细胞相容性通过MTT实验评价。如图2所示，浸提液处理组的相对增殖率与对照组相比在第一天没有显著性的差异。在第2天和第3天，浸提液处理组的相对细胞增殖率逐渐降低，说明复合止血膜材料对皮肤细胞生长具有一定的抑制作用。然而，浸提液处理组的相对细胞增殖率始终超过80%，参照细胞毒性分级标准GB/T168886.5-2003，该大豆分离蛋白/γ-聚谷氨酸复合止血膜的细胞毒性达到了生物医用材料1类标准，满足伤口敷料细胞毒性的一般要求。

图2 大豆分离蛋白/γ-聚谷氨酸复合止血膜细胞相容性的结果

2.3 大豆分离蛋白/γ-聚谷氨酸复合止血膜的促凝血功能

复合止血膜的促凝血功能通过新鲜兔乏血小板血浆测定。如图3所示，正常对照组的活化部分凝血活酶时间APTT为（28.77±0.66）s，在正常参考范围之内。复合止血膜处理组的活化部分凝血酶原时间APTT为（24.80±0.86）s，显著低于正常对照组，其差异均具有统计学意义（P＜0.05）。上述实验结果表明：大豆分离蛋白/γ-聚谷氨酸复合止血膜能够激活血浆内源性凝血途径和共同途径，具有一定的止血促凝功效，有望应用于伤口止血。

图3 大豆分离蛋白/γ-聚谷氨酸复合止血膜的活化部分凝血活酶时间

3 总结

本研究制备了一种乙二醇二缩水甘油醚交联的大豆分离蛋白/γ-聚谷氨酸复合止血膜。扫描电子显微镜的结果表明该复合止血膜具有均一的表面和断面结构，组分高分子之间具有良好的亲和性。MTT实验结果表明该复合止血膜具有较好的细胞相容性，符合生物材料1类标准。血浆抗凝实验结果表明该复合止血膜能够激活内源性凝血途径和共同通路途径，具有一定的止血促凝效果。本研究制备的大豆分离蛋白/γ-聚谷氨酸复合止血膜可以作为新型伤口敷料，有望应用于皮肤组织工程领域。