刘梓健，彭宝洲，粟海波

（广州医科大学-广州生物医药与健康研究院联合生命科学学院，广东广州 511436）

结核病（tuberculosis，TB）由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）感染引起，是所有疾病中最致命的传染性疾病。据世界卫生组织统计，2017年结核病仍然是全世界最具威胁性的细菌感染病，死亡人数多达170万人，全球约有1/4的人口有结核分枝杆菌潜伏感染[1-2]。卡介苗（BCG）疫苗作为唯一全球广泛使用的疫苗，不足以防治Mtb感染。目前，多种新疫苗保护效果不能完全令人满意。并且随着越来越多的Mtb菌株对现有抗结核药物产生抗药性，防治TB非常严峻[3-5]。因此，根据之前的不足，研究结核病发病机制以及寻找新型、高效结核疫苗，防治结核病有着重大的意义。

直接研究Mtb影响了抗结核药物研发的效率。由于海分枝杆菌（Mycobacterium Marinum，M.Marinum）与MTB的基因相似性高达95%以上，且其生长更快、毒力更小、传染性更低，研究可在二级生物实验室内进行，因而M.Marinum是研究Mtb的优良模式病原[6]。

绿色荧光蛋白（Green Fluorescence Protein，GFP）由GFP基因编码，在近紫外或蓝光激发时就能辐射出绿色荧光，因而GFP常常作为分子生物学和细胞生物学中用于示踪和定量的研究工具[5,7]。

本研究中，将增强型绿色荧光蛋白基因（EGFP）克隆到海分枝杆菌的表达载体pMV261，利用EGFP为示踪基因标记M.Marinum，有利于后续观察其基因表达调控，将对研究TB发病机制以及研制新型结核疫苗有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

pMV261质粒；pEGFP-N1细菌；引物P1（5'-GGGGTACCAGCTCAAGCTTCGAATTCTGC-3'）和 P2（5'-CCATCGATACCTCTACAAATGTGGTAT GGCT-3'），下画线部分分别为kpnⅠ和ClaⅠ酶切位点，由上海生物工程有限公司合成；kanamycin sulfate、限制性内切酶ClaⅠ和kpnⅠ购自上海生物工程有限公司；DNA凝胶回收试剂盒购自Takara；Hot Start Taq 2× Master Mix购 自 BioLabs；T4DNA连接酶、DH5α感受态细胞、质粒小提试剂盒购自TIANGEN；电击杯购自BIORAD。

1.2 方法

1.2.1 增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的扩增

质粒pEGFP-N1为模版，P1和P2为引物，PCR反应体系（50 μL）：Taq 2× Master Mix 25 μL，引物P1和P2各1 μL，pEGFP-N1质粒1 μL，超纯水22 μL。反应条件如下：95 ℃预变性3 min；再分别95 ℃变性 30 s、56 ℃复性 1 min、68 ℃延伸 1 min，30个循环；最后68 ℃延伸5 min；4 ℃保存。PCR产物用DNA纯化试剂盒回收和纯化，并取适量样品用1.5%琼脂糖凝胶进行鉴定。

1.2.2 含有EGFP基因重组表达质粒pMV261-EGFP的构建

将回收纯化的PCR产物用kpnⅠ和ClaⅠ双酶切并用DNA纯化试剂盒纯化回收。pMV261质粒用kpnⅠ和ClaⅠ双酶切后，用1%的琼脂糖凝胶进行鉴定，并且进行胶回收。酶切产物分别回收后，利用T4DNA连接酶于4 ℃连接过夜，产物转化入E.coli DH5α后，涂布于含0.1% kanamycin sulfate的LB琼脂平板。37℃培养过夜，挑取抗性菌落，并摇菌扩培。

1.2.3 pMV261-EGFP重组质粒的鉴定

从含有pMV261-EGFP的大肠杆菌中提取质粒。以P1和P2为引物，利用PCR技术扩增重组质粒上的目的基因，再通过1%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。鉴定成功后，通过测序鉴定目的基因序列。

1.2.4 海分枝杆菌的电感受态细胞的制备和电转化

将海分枝杆菌接种于10 mL 7H9液体培养基中培养3天，离心收集细菌。先后分别用10 mL、2 mL冰冷的10%甘油灭菌水溶液冰浴2 h，离心弃上清。500 μL的10%甘油重悬细胞后，分装制成多管海分枝杆菌的电感受态细胞，-80 ℃冻存备用。100 μL海分枝杆菌的电感受态细胞中加入5 μL重组质粒pMV261-EGFP，混匀，移入0.2 mm的电击杯，冰浴放置10 min。利用电击杯仪进行电转化。反应条件：电阻1 000 Ω，电压2.5 kV，电容25 μF，转化时间17 ms。电转后立即将细菌转入10 mL 7H9液体培养基振荡培养4 h。离心收集菌体，立即涂布于含0.1%kanamycin sulfate的7H10琼脂平板。37 ℃培养3天。挑取卡那霉素抗性的单菌落，分别接种于5 mL含0.1%kanamycin sulfate的7H9液体培养基，37 ℃培养 3 天[7]。

1.2.5 Western blot检测重组质粒EGFP蛋白的表达

裂解适量细胞后，上清中取4 μL待测蛋白加入到1 μL 4×上样缓冲液。95 ℃变性5 min后，先后进行12% SDS-PAGE电泳和电转膜。用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液室温摇床封闭2 h。TBST缓冲液洗膜3次，每次5 min。室温下分别用anti-GFP一抗和anti-Rv21453一抗孵育PVDF膜，4 ℃过夜孵育。孵育后，洗膜3次，每次10 min。再与羊抗小鼠IgG二抗室温下孵育1 h。洗膜3次，每次10 min。最后化学发光显色。

1.2.6 海分枝杆菌感染THP-1吞噬细胞模型建立

感染时按细菌∶细胞=10∶1的比例，取适量细菌悬液加入已经贴壁培养的THP-1细胞六孔板中，37 ℃，5% CO2细胞培养箱中孵育1天。制备感染海分枝杆菌的THP-1巨噬细胞标本，于激光共聚焦显微镜下观察。

2 结果分析

2.1 EGFP基因的扩增结果

EGFP纯化后，在1.5%的琼脂糖凝胶下电泳，在约700 bp处可见1条特异DNA条带，如图1所示。预期大小约为717 bp，扩增结果与预期相符。

图1 EGFP基因PCR扩增结果

2.2 pMV261-EGFP重组质粒的鉴定结果

连接产物用引物P1、P2进行PCR扩增。结果与预期的大小相符，在约700 bp处有一条特异DNA条带（图2），对阳性克隆重组质粒pMV261-EGFP进行序列测定，目的基因序列与预期的一致，说明重组质粒pMV261-EGFP构建成功。

图2 重组质粒pMV261-EGFP PCR鉴定结果

2.3 Western blot检测结果

Western blot结果表明，海分枝杆菌内EGFP蛋白表达，印迹出现位置约为25 kDa处，如图3所示。

图3 Western blotting结果

2.4 重组海分枝杆菌的证实

构建海分枝杆菌感染TPH-1巨噬细胞模型，并制备成相应的标本，置于激光共聚焦显微镜下观察，可见TPH-1巨噬细胞内有释放绿色荧光的海分枝杆菌（图4），故海分枝杆菌感染TPH-1巨噬细胞模型构建成功，证实转化pMV261-EGFP的重组海分枝杆菌构建成功。

图4 重组结核分枝杆菌的荧光鉴定

3 讨论

耐多药结核病（MDR-TB）的流行以及广泛耐药结核病（XDR-TB）的出现，导致多种候选疫苗在抗结核潜伏感染临床保护效果及运用前景方面尚不能完全令人满意，这也表明人类结核病正在加入抗生素后时代的细菌性疾病。TB对人类健康的持续造成威胁，对全球结核病疾病控制带来了巨大挑战。寻求新型、安全、高效的抗结核药物是一个重要的研究课题[4-5]。结合之前对防治TB的研究，再次研究结核发病机制以及研制新型疫苗是有必要及可行的。

由于Mtb生长缓慢，而且受到其生物安全性的极大制约，故制约了对细菌致病性研究以及抗结核药物研发的效率。M.Marinum生长更快、毒力更小、传染性更低，对实验环境条件要求较低，便于后续通过构建斑马鱼海分枝杆菌模型进行基础研究。

增强型绿色荧光蛋白（EGFP）作为报告基因，它具有多方面的优点。（1）它易于构建载体，转化后细胞也可以继续传代。（2）作为荧光标记分子，荧光的产生不需要任何外加底物，酶或其他共反应因子，荧光稳定。因而其表达与激光共聚焦显微镜结合，可方便观察转染后细胞的增殖和分化等生理功能变化[5,7-10]。

本研究中，构建了重组质粒pMV261-EGFP，并使该重组质粒pMV261-EGFP在M.Marinum中稳定存在并表达，成功获得可自发释放荧光的M.Marinum。这将便于后续研究MTB的基因表达调控、结核病发病机制以及研制新型结核疫苗，以期对结核病的早期发现、成功治疗和有效的预防有更新发现。