王 晶,李爱莉,孙 超,丁 旭,黄艳红

(空军军医大学第一附属医院妇产科生殖中心,西安 710032)

随着玻璃化冷冻技术的日益成熟,冻融胚胎移植(frozen-thawed embryo transfer,FET)已越来越广泛应用于临床。FET可保存新鲜移植后剩余胚胎,增加患者累计临床妊娠率,减轻卵巢过度刺激综合征(OHSS)的发病风险,减少多胎妊娠发生率[1-3],同时降低早产率,围生期死亡率以及新生儿低体重儿出生率[4,5]。影响FET能否获得妊娠的因素有很多,如患者年龄、内膜情况、胚胎情况等[6],但就胚胎而言包括冷冻前胚胎发育速度和形态学评价、复苏后胚胎损伤程度以及卵裂球复苏情况。目前关于FET的研究很大一部分集中在卵裂球损伤胚胎移植后的临床结局,而对卵裂球损伤胚胎能否继续发育及发育情况的不同对临床结局的影响研究较少[7]。本研究旨在探讨复苏后胚胎卵裂球完整性及继续发育与FET妊娠结局的关系,从而更好地为FET周期挑选较高植入潜能和发育潜能的胚胎提供参考,以提高冻融胚胎移植周期妊娠率。

1 资料与方法

1.1 研究对象及分组

选择2015-10～2016-10在本中心进行FET的患者420对夫妇,新鲜周期形成的胚胎,经患者夫妇同意将其予以冻存。根据解冻后移植胚胎的卵裂球的完整程度分组:解冻后移植胚胎的卵裂球均完整,为完整组,共312例;解冻后移植胚胎至少有一个卵裂球损伤但损伤比例≤50%,为损伤组,共108例。根据解冻后体外培养18-24 h内胚胎恢复有丝分裂的情况分别将完整组和损伤组分为3个亚组:完整组A1和损伤组B1(所有胚胎均恢复有丝分裂的FET周期组),完整组A2和损伤组B2(部分胚胎恢复有丝分裂的FET周期组),完整组A3和损伤组B3(无胚胎恢复有丝分裂的FET周期组)。

1.2 试剂

胚胎冷冻液VitrificationVT101和胚胎解冻液VitrificationVT102(KITAZATO,日本加藤公司),胚胎培养液Global total(美国Global公司)。

1.3 胚胎冷冻选择标准

根据形态学参数,将体外培养3 d(D3)卵裂期胚胎分为以下4级:Ⅰ级,卵裂球8-10个,卵裂球均匀、细胞质均一、无空泡,碎片≤5%;Ⅱ级,4≤卵裂球≤6个或卵裂球≥10个,卵裂球均匀或略不均匀,细胞质均一、无空泡,碎片占5%-15%;Ⅲ级,卵裂球≥4个,同时卵裂球明显不均匀,细胞质中有少量空泡,碎片15%-30%;Ⅳ级,卵裂球≤4个,卵裂球明显不均匀、细胞质不均一、或有大量空泡,碎片占30%-50%。其中Ⅰ级和Ⅱ级为优质胚胎;Ⅰ级、Ⅱ级和Ⅲ级为可移植/可冻融胚胎。

1.4 方法

1.4.1 胚胎冷冻 冷冻载体选用型号为Cryotop (KITAZATO,日本加藤公司)。室温下,将2-3个胚胎置于平衡液(equilibration solution,ES)中5 min,平衡结束后将ES中的胚胎放置于玻璃化液(vitrification solution,VS)表面,轻轻来回吹吸数次,在45 s内将胚胎放到冷冻载体前段标记位置,确认胚胎在载体上后,迅速投入液氮中,并在液氮中完成装杆过程。

1.4.2 胚胎复苏 确认冷冻管及冷冻载体患者信息无误后,将载体在液氮中取掉套管后拿出,迅速浸入37 ℃解冻液(thawing solution,TS)中,使胚胎滑落入TS中,1 min后,按照浓度梯度递减的顺序,依次将胚胎移入稀释液(diluent solution,DS)中3 min,洗涤液1(washing solution,WS1)中5 min,洗涤液2(washing solution,WS2)中5 min,最后置于预先在37 ℃、含5%CO2的培养箱内平衡好的胚胎培养液中培养。

1.4.3 内膜准备及黄体支持 月经周期规律、排卵正常的患者采用自然周期法,即于月经第12天开始用阴道B超和空腹血液中LH及P激素水平监测评估卵泡发育及排卵,于排卵当天开始每日阴道填塞黄体酮软胶囊(安琪坦,法国法杏大药厂)600 mg。在排卵后第3天解冻胚胎,选择1-3枚胚胎移植。排卵异常的患者采用激素替代法,即于月经第3天起以递增法口服戊酸雌二醇片(补佳乐,德国拜耳公司),阴式B超监测子宫内膜,子宫内膜厚度达9-12 mm时,开始每日阴道填塞黄体酮软胶囊600 mg。使用黄体酮软胶囊后第3天解冻胚胎,选择1-3枚胚胎移植。

1.4.4 胚胎移植 移植前嘱咐患者多饮水,充盈膀胱,移植时患者仰卧于移植床上,常规清洁外阴及阴道,阴道窥器暴露宫颈去除宫颈黏液。在腹部超声引导下,根据内膜形态及厚度,将载有1-3枚胚胎的移植管(wallace,英国)的内管顶端送至宫腔中或中下段,缓慢注入装有胚胎的移植液至子宫腔,推注完毕停留约5-10 s,缓慢退出内管。移植管送实验室检查,在显微镜下观察确定无胚胎遗留后,完成移植。术后患者平卧休息1 h左右。

1.4.5 妊娠判断标准 胚胎移植后14 d,检测血β-人绒毛膜促性腺激素(β-human chorionic gonadotropin,β-HCG),阳性者为生化妊娠,移植后4周超声检查,有孕囊及原始心管搏动即诊断为临床妊娠。临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植周期数,种植率=孕囊数/移植胚胎数。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 卵裂球完整组与损伤组临床结局的比较

两组患者年龄、冻融胚胎移植日子宫内膜厚度、平均移植胚胎数比较,差异无统计学意义(P>0.05)。两组患者临床妊娠率无统计学意义(P>0.05),而其胚胎种植率有显著差异(P<0.05,见表1)。

表1 卵裂球完整组与损伤组临床结局的比较Table 1 Comparison of the clinical outcomes between intact group and injury group

与完整组A比较,*P<0.05

2.2 卵裂球完整性及进一步恢复卵裂情况与临床结局的关系

完整组A1、A2和A3亚组在患者年龄、内膜厚度、移植胚胎数方面比较差异无统计学意义(P>0.05)。完整组A1比完整组A3有更高的临床妊娠率和胚胎种植率,差异有统计学意义(P<0.05),而完整组A1与A2组,A2与A3组之间临床妊娠率和胚胎种植率比较差异无统计学意义(P>0.05,见表2)。

损伤组B1、B2和B3在患者年龄、内膜厚度、移植胚胎数方面比较差异无统计学意义(P>0.05)。损伤组B1与B3组在临床妊娠率比较差异无统计学意义(P>0.05),但是损伤组B1相对B3组有更高的胚胎种植率,差异有统计学意义(P<0.05),而损伤组B1和B2组,损伤组B2和B3两组之间临床妊娠率和胚胎种植率比较差异无统计学意义(P>0.05,见表2)。

完整组A1与损伤组B1、完整组A2与损伤组B2、完整组A3与损伤组B3在患者年龄、内膜厚度、移植胚胎数方面比较差异无统计学意义(P>0.05)。完整组A1、完整组A2与损伤组B1、损伤组B2临床妊娠率比较差异无统计学意义(P>0.05),但是完整组A1、完整组A2相对损伤组B1、损伤组B2有更高的胚胎种植率,差异有统计学意义(P<0.05),而完整A3与损伤组B3两组之间临床妊娠率和胚胎种植率比较差异无统计学意义(P>0.05,见表2)。

表2 卵裂球完整性及进一步恢复卵裂情况与临床结局的关系Table 2 Relationship between embryo blastomere integrity,situation of embryo recovery and clinical outcome

与完整组A1比较,*P<0.05;与完整组A2比较,#P<0.05;与损伤组B1比较,ΔP<0.05;完整组A1,损伤组B1为所有胚胎均恢复有丝分裂的FET周期组;完整组A2,损伤组B2为部分胚胎恢复有丝分裂的FET周期组;完整组A3,损伤组B3为无胚胎恢复有丝分裂的FET周期组

3 讨论

FET技术是现代辅助生殖技术重要的衍生技术之一,随着玻璃化冷冻技术的日益成熟,FET已越来越广泛应用于临床。影响FET能否获得妊娠的因素有很多,如患者年龄、内膜情况、胚胎情况等,但就胚胎而言包括冷冻前胚胎发育速度和形态学评价、复苏后胚胎损伤程度以及卵裂球复苏情况。研究证实,冻融胚胎的完整性和发育潜能是影响冷冻周期妊娠率的重要因素[8,9]。胚胎卵裂球损伤在冻融过程中比较常见。胚胎卵裂球出现不同程度的损伤后,移植这些卵裂球受损胚胎是否影响妊娠和植入呢?这个问题一直是生殖界关注和争论的焦点之一。有研究显示移植1-2个卵裂球受损胚胎与完整存活胚胎具有相似的妊娠率[10]。而有研究则认为,受损胚胎降低妊娠率和胚胎植入能力,移植部分受损胚胎的种植率比完整存活胚胎低[11]。而胚胎的发育潜能通过过夜培养后是否能够恢复有丝分裂继续生长来评判。孙贻娟等[12]的研究表明胚胎在解冻后4 h有丝分裂即可恢复,冻融胚胎有丝分裂的恢复预示着胚胎有良好的发育潜能和更好的临床结局。

本研究综合考虑了冻融胚胎的完整性和发育潜能两方面的因素,深入探讨了这两种因素对临床结局的影响,结果显示卵裂球完整的冻融胚胎,在患者年龄、内膜厚度、移植胚胎数等因素无统计学差异的前提下,全部胚胎恢复有丝分裂组与无胚胎恢复有丝分裂组相比,有着更高的临床妊娠率和胚胎种植率,且存在统计学差异,而这两组与部分恢复有丝分裂组胚胎相比较指标均无统计学差异。对于卵裂球损伤的冻融胚胎,在患者年龄、内膜厚度、移植胚胎数等因素无统计学差异的前提下,全部胚胎恢复有丝分裂组与无胚胎恢复有丝分裂组相比,有着更高的胚胎种植率,且存在统计学差异,而这两组之间的临床妊娠率并无统计学差异。与卵裂球完整组相同的是,部分生长的卵裂球损伤胚胎与全部生长和无生长组相比较两组指标也均无统计学差异。这些结果也表明,无论是卵裂球完整胚胎还是部分卵裂球损伤的胚胎,如果在体外培养中能继续发育,仍提示有较好的妊娠结局;但如果胚胎继续培养中没有进一步发育,多提示胚胎的发育潜力较低,临床预后较差。

在有同样继续发育情况的前提下,移植卵裂球损伤胚胎组比移植完整存活胚胎组的胚胎种植率明显降低,差异存在统计学意义(P<0.05),提示卵裂球受损影响胚胎的植入潜力,与种植率密切相关。部分卵裂球损伤的胚胎着床能力降低,可能原因是损伤后的卵裂球分解代谢产生某些毒性物质,可影响其他卵裂球的继续卵裂、孵出乃至种植潜能[13]。

综上所述,冻融胚胎解冻后可通过过夜培养,甄选有发育潜能的胚胎进行移植,以改善妊娠结局。而无论胚胎本身是否发生损伤,过夜培养后又全部未继续发育的胚胎,应慎重考虑该周期是否进行移植。