随着人口老龄化的加速，我国缺血性脑血管病发病率呈逐年上升的趋势，临床上采取紧急药物溶栓及介入手术等治疗手段虽然能够挽救部分病人生命，但缺血再灌注损伤仍严重影响着该类病人预后。Wang 等[1]研究发现继发性神经细胞凋亡是脑组织缺血再灌注损伤重要的病理基础，因此以抑制细胞凋亡为靶点研究新型药物，或许是降低缺血再灌注损伤的新途径。熊果酸(ursolic acid， UA)是一种五环三萜类化合物，陈鹏等[2]研究发现熊果酸能够通过改善抗氧化酶活性、降低氧化应激损伤而表现出对脑缺血再灌注损伤具有一定的保护作用，周宁等[3]和赵瑞芳等[4]研究发现熊果酸通过抑制细胞凋亡而对肠系膜缺血损伤和心肌缺血再灌注损伤起到一定的保护作用，但熊果酸是否对脑缺血再灌注损伤后神经细胞凋亡具有抑制作用尚少有文献报道。本实验通过制备局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠模型并腹腔注射熊果酸进行治疗，研究熊果酸不同剂量对神经细胞凋亡的抑制作用，进而探讨其对局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂 熊果酸购自陕西慧科植物开发有限公司，纯度≥98%，20141125；TUNEL试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司；AKT、bcl-2、Bax上下游引物购自上海博亚生物公司；caspase-3、核转录因子-κB(NF-κB)单克隆抗体购自碧云天生物技术有限公司。

1.2 实验动物 清洁级雄性SD大鼠，7周龄，260 g～300 g，购自河北省实验动物中心，动物许可证号：SCXK(冀)2013-1-003。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组与模型制备 取100只实验用SD大鼠按照随机数字表法分为假手术组、模型组和熊果酸低剂量组(20 mg/kg)、中剂量组(40 mg/kg)、高剂量组(80 mg/kg)，每组20只。模型组及熊果酸各剂量组大鼠均参照Longa 等[5]报道的线栓法复制模型；假手术组大鼠除不插入栓线外，其余手术操作同模型组；熊果酸各剂量组分别于再灌注前30 min通过腹腔注射给药，假手术组和模型组同步给予等体积生理盐水。再灌注24 h后进行各指标的观察和检测。

1.3.2 神经功能评分 参照10分制评分方法行盲法评分：置地上，向缺血对侧转圈，计1分；提鼠尾，缺血对侧前肢出现腕屈曲、肘屈曲、肩内旋，分别计1分、2分、3分；对侧推动时阻力下降，据下降程度计1分～3分；置金属网上，据缺血对侧肌张力下降程度计1分～3分。

1.3.3 脑组织含水量和梗死体积的测定 麻醉后断头取脑，去除小脑和低位脑干后称重大脑组织重量，即为湿重量(W)；110 ℃恒温烘烤48 h后称重为干重量(D)：脑含水量(%)=[(W-D)/W]×100%；麻醉后断头取大脑组织，沿冠状切片(厚度约2 mm)，置于1% TTC染色液中恒温(37 ℃)避光孵育30 min(正常脑组织呈红色、梗死区呈苍白色)，然后通过图像分析软件Imagepro Plus 6.0计算梗死体积百分比。

1.3.4 脑组织结构形态学改变的观察 取大脑组织并依次经4%多聚甲醛溶液固定、石蜡包埋、切片、脱蜡水化等处理后，行TUNEL染色并通过倒置光学显微镜观察神经细胞凋亡状况(细胞核黄染为阳性着色)。凋亡指数(AI)的计算：每张切片于相同位置随机选取互不重叠的6个视野，计数视野内细胞总数和凋亡细胞数，然后计算AI：AI(%)=(凋亡细胞数/细胞总数)×100%。

1.3.5 脑组织中bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达的检测 查阅并设计大鼠Bax、bcl-2、β-actin基因cDNA序列；取大脑组织并研磨匀浆，加入适量TRIzol试剂提取总RNA并测定总RNA浓度，取1 μg RNA反转录为cDNA后进行PCR反应进行扩增，取PCR产物于琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像仪观察并照相；根据条带灰度值，以β-actin为内参半定量分析bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达，然后计算bcl-2/Bax比值。

1.3.6 脑组织caspase-3、NF-κB蛋白表达的检测 取脑组织匀浆液，经12 000 r/min低温(4℃)离心10 min后取上清液，然后通过蛋白免疫印迹法测定caspase-3、NF-κB蛋白表达：高温变性(沸水浴加热5 min)、上样(每孔上样30 μg)，电泳、转膜、春红溶液染色后，室温下5%脱脂奶粉封闭2 h，一抗(1∶500)caspase-3、NF-κB、β-actin 4℃过夜；洗膜，二抗(1∶100)室温摇床上孵育1 h后经ECL显色，以β-actin为内参，以条带灰度值测定caspase-3、NF-κB蛋白表达相对量并计算Bax/bcl-2比值。

2 结 果

2.1 熊果酸对大鼠神经功能评分、脑组织含水量及脑梗死体积的影响 模型组大鼠神经功能评分、脑组织含水量和脑梗死体积较假手术组均升高(P<0.01)；与模型组比较，熊果酸中、高剂量组神经功能评分、脑组织含水量和脑梗死体积均降低(P<0.05或P<0.01)。详见表1。

表1 各组大鼠神经功能评分、脑组织含水量及脑组织梗死体积(±s)

2.2 熊果酸对大鼠神经细胞凋亡状况及AI的影响 模型组大鼠脑组织神经细胞凋亡数量较假手术组明显增多，而熊果酸各剂量组神经细胞凋亡数量较模型组均明显减少，以熊果酸高剂量组效果最为显著。模型组大鼠神经细胞AI较假手术组升高(P<0.01)；熊果酸中、高剂量组神经细胞AI较模型组降低(P<0.01)。详见图1、表2。

A为假手术组；B为模型组；C为熊果酸低剂量组；D为熊果酸中剂量组；E为熊果酸高剂量组。

表2 各组大鼠神经细胞AI比较(±s)%

2.3 熊果酸对大鼠脑组织bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达的影响 模型组脑组织bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达较假手术组上调(P<0.05或P<0.01)，bcl-2/Bax比值降低(P<0.01)；熊果酸中、高剂量组大鼠bcl-2 mRNA表达上调，Bax mRNA下调，bcl-2/Bax比值升高，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。详见表3。

表3 各组大鼠bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达及bcl-2/Bax比值(±s)

2.4 熊果酸对大鼠脑组织caspase-3、NF-κB蛋白表达的影响 模型组脑组织caspase-3、NF-κB蛋白表达较假手术组上调(P<0.01)；熊果酸中、高剂量组caspase-3、NF-κB蛋白表达较模型组均下调(P<0.05或P<0.01)。详见图2、表4。

图2 各组大鼠脑组织NF-κB、caspase-3蛋白表达电泳图

A为假手术组；B为模型组；C为熊果酸低剂量组；D为熊果酸中剂量组；E为熊果酸高剂量组。

表4 各组大鼠脑组织中caspase-3、NF-κB蛋白表达(±s)

3 讨 论

细胞凋亡是一种细胞程序化死亡过程，由多种基因参与调控，其中bcl-2为抑凋亡基因而Bax为促凋亡基因，二者间相互作用、共同参与调控细胞凋亡过程[6]；Bax能够与bcl-2聚合成二聚体，从而抑制bcl-2活性而促进细胞凋亡，所以Bax/bcl-2比值更加能够体现Bcl-2基因家族对细胞凋亡的调控作用[7]。Caspase是激活各种凋亡刺激因子的关键蛋白酶，参与细胞凋亡过程[8]。NF-κB是一种多效能核转录因子，Zhang 等[9]研究发现，活化的NF-κB能够促进巨噬细胞活化和浸润，诱导促凋亡信号释放而导致细胞凋亡；生理状态下NF-κB以无活性形式存在于胞质中，而当细胞受到细胞活性氧(ROS)攻击时，NF-κB将被活化并暴露出核定位信号而进入胞核内，与凋亡相关基因如c-myc等NF-κB调控元件结合，促进基因转录并诱导细胞凋亡[10]；此外，活化的NF-κB蛋白还能够促进巨噬细胞活化和浸润、诱导促凋亡信号释放而导致细胞凋亡[9]。

本研究发现：经熊果酸(40～80)mg/kg干预治疗能够显著改善局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能症状，降低脑梗死体积和脑组织含水量。与模型组比较，经熊果酸(40～80)mg/kg治疗能够抑制神经细胞凋亡并降低凋亡指数；上调bcl-2 mRNA表达、下调Bax mRNA表达，提高bcl-2/Bax比值，下调caspase-3、NF-κB蛋白表达。提示熊果酸可能通过抑制神经细胞凋亡而对局灶性脑缺血再灌注损伤起到一定的保护作用，其机制可能与熊果酸调节凋亡相关基因蛋白表达有关。