袁跃华， 朱永军， 殷强锋， 冯 锋， 王海雁， 田茂忠*

(1.山西大同大学化学与环境工程学院，山西大同 0370092.华东理工大学化工学院，上海 200237)

铜是自然界和生物体中特别重要的过渡金属元素之一，Cu2+的缺少或过量存在对生物体有不利影响[1 - 2]，会引起动植物病变甚至死亡，因此，监控生物体内和环境载体中Cu2+的浓度十分必要。

相对于其他方法，荧光检测分析方法具有选择性好、灵敏度高[3]等优点，故基于荧光检测方法的Cu2+探针的研究近年来引起了众多科学工作者的关注[4 - 8]。由于Cu2+具有顺磁性特点，Cu2+的检测往往会引起探针的荧光信号猝灭[9]，从而不利于提高检测的灵敏度。但是，具有内酰肼螺环结构的罗丹明类染料识别Cu2+前处于不发光的非共轭状态，当探针分子与Cu2+发生作用时，可引发螺环开环，开启共轭体系，恢复罗丹明荧光团的发光性能，从而达到通过荧光增强检测Cu2+的目的[10 - 14]。

到目前为止，已有大量的文献报道基于罗丹明内酰胺的金属离子探针[15 - 17]。从其结构和性能来看，在识别金属离子后罗丹明6G类荧光探针的最大发射波长比罗丹明B类荧光探针的小。一般来说，罗丹明酰胺类荧光探针的识别机理是金属离子络合诱导螺环开环后使得探针荧光增强，识别金属离子的过程可逆；但是，罗丹明酰肼类荧光探针有时识别金属离子过程不可逆，探针荧光增强是由于金属离子诱导其螺环开环，然后发生水解反应所致。本文基于Cu2+可促进罗丹明螺环内酰胺水解的机制[18]，以双罗丹明6G为荧光基团，设计合成了Cu2+选择性反应型螺环酰肼荧光探针分子RG1。 实验结果表明，引入两个水合肼基官能团不但增强了探针的水溶性，并保持了其肼类衍生物的识别性能。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

F-2500荧光分光光度计(日本，日立公司)；pHS-25B 型pH酸度计(上海大中分析仪器厂)；DRX-400核磁共振仪(瑞士，Bruker公司)；Saturn 2200/2100 质谱仪(美国，Varian 公司)；SHZ-D 循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限公司)；R215型旋转蒸发仪(瑞士，BUCHI公司)。

RG1标准溶液：准确称取一定量探针RG1，溶于二甲亚砜(DMSO)，制成浓度为1.0×10-2mol/L的贮备液，使用时根据需要适当稀释。金属离子溶液：准确称取一定量各金属离子硝酸盐，溶于二次蒸馏水中，制成浓度为2.0×10-2mol/L的贮备液，使用时根据需要适当稀释。罗丹明6G购自百灵威试剂有限公司；水合肼(85%)、乙二醛(40%)和其它试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。所有试剂均为分析纯。柱层析硅胶为200～300目(青岛Makall公司)。水为二次蒸馏水。

1.2 探针的制备

探针的合成路线如下所示：

1.2.1化合物RG3的合成参照文献方法[15]，将罗丹明6G 2.0 g(4.5 mmol)加入装有50 mL乙醇的100 mL烧瓶中。室温下，剧烈搅拌，慢慢滴入85%的水合肼6.0 mL(过量)。滴加完毕后，搅拌回流2 h。冷却溶液，减压蒸去乙醇。然后加入大约100 mL HCl(1 mol/L)，得到红色溶液；不断搅拌下，再慢慢加入大约140 mL NaOH溶液(1 mol/L)，直到pH达到9～10之间，出现大量白色沉淀。过滤，并用30 mL水洗涤滤饼3次。真空干燥后，初产品用柱色谱分离得到1.18 g化合物RG3(60.9%)。

1.2.2化合物RG2的合成将RG3 500.0 mg(1.2 mmol)加入50 mL的单口烧瓶中，再加入15 mL无水甲醇和40%乙二醛水溶液1.0 mL，然后在氮气保护下，室温搅拌8 h，减压蒸去溶剂。把粗产品溶在2 mL 的二氯甲烷中，用硅胶柱色谱分离，洗脱剂为石油醚∶乙酸乙酯=6∶1(V∶V),得到317.3 mg的黄色固体RG2(30.9%)。1H NMR(400 MHz,CD3CN) δH9.23(s,1H),9.21(s,1H),7.97(d,J=7.6 Hz,1H),7.65～7.52(m,4H),7.43(d,J=7.6 Hz,2H),7.03(d,J=7.6 Hz,1H),6.34(s,4H),6.28(s,4H),4.17(s,2H),3.18(q,J=7.2 Hz,8H),2.13(s,2H),1.85(s,12H),1.24(t,J=7.2 Hz,12H)。13C NMR(100 MHz,CD3CN) δC192.15,187.78,165.26,153.01,151.48,148.63,140.57,135.49,128.99,127.59,124.33,119.63,103.98,96.34,65.85,37.97,16.10,13.61。HRMS:m/z计算值:C54H55N8O4[M+H]+:879.4346，实测值:879.4341。

1.2.3化合物RG1的合成将RG2 200.0 mg(0.2 mmol)加入50 mL的单口梨形烧瓶中，再加入10 mL无水乙醇，然后在氮气保护及室温搅拌下，慢慢分多次加入NaBH415.2 mg(0.4 mmol),加完后室温下再搅拌2 h。减压蒸去溶剂，粗产品溶于10 mL二氯甲烷中，加入3 mL K2CO3溶液(0.1 mol/L)，有机相用无水MgSO4干燥，过滤，蒸去溶剂，把固体溶在2 mL的二氯甲烷中。用硅胶柱色谱分离，洗脱剂为石油醚∶乙酸乙酯=2∶1(V∶V),得到184.1 mg的白色固体RG1(91.6%)。1H NMR(400 MHz,CDCl3) δ 7.92(dd,J=5.9,2.7 Hz,2H),7.57～7.39(m,4H),7.08(dd,J=5.9,2.7 Hz,2H),6.36(s,4H),6.18(s,4H),4.55(t,J=7.0 Hz,2H),4.39(t,J=7.0 Hz,2H),3.51(s,4H),3.32～3.33(d,2H),3.19(m,8H),1.88(s,12H)。1.30(t,J=7.1 Hz,12H)。13C NMR(100 MHz,CDCl3) δ 178.88,167.99,152.12,151.45,147.45,133.00,129.67,128.29,127.92,123.94,122.87,117.69,105.43,96.61,66.24,58.43,52.43,38.25,16.62,14.64。HRMS:m/z计算值:C54H59N8O4[M+H]+:883.4659，实测值:883.4667。

2 结果与讨论

2.1 紫外-可见光谱分析

图1 探针RG1(10 μmol/L)对金属离子(浓度均为50 μmol/L)响应的紫外-可见(UV-Vis)光谱Fig.1 UV-Vis response of probe RG1(10 μmol/L) to different metal ions(50 μmol/L)

通过紫外-可见光谱研究了探针分子RG1对Cu2+的识别作用。由图1可见，在体积比为1∶1的乙腈-水溶液(10 mmol/L Tris-HCl，pH=7.2)体系中，探针分子RG1(10 μmol/L)在可见光谱区(400～700 nm)几乎没有吸收，当加入Cu2+后，紫外-可见光谱在525 nm处出现很强的吸收峰，同时溶液颜色从无色变为粉红色。这种现象表明探针分子RG1对Cu2+有良好的识别功能。Cu2+诱导探针分子的罗丹明内酰肼螺环打开，使得摩尔吸光系数大幅度增大，可达到4.81×104L/(mol·cm)。另外，还研究了其它常见的金属离子，如Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Ba2+、Fe3+、Ni2+、Cr3+、Cd2+、Mn2+、Pb2+、Ag+、Zn2+、Hg2+与探针分子RG1之间的相互识别作用。从图中可以发现，除了Fe3+可引起荧光分子探针RG1的吸收强度稍微增加外，其它金属离子均未引起探针分子RG1可见区吸光度较明显的增大，溶液颜色也未发生明显变化。所以，探针RG1可以用作Cu2+的显色传感。

2.2 荧光光谱分析

在相同的乙腈-水溶液体系中，利用荧光光谱评价了探针分子RG1对上述常见金属阳离子的识别功能。由图2(A)可见，当用510 nm的光激发时，探针分子RG1(10 μmol/L)的荧光强度很弱。当向探针溶液中加入一定浓度的Cu2+后，发现探针分子RG1的荧光增强非常明显。除了Fe3+对探针的荧光光谱稍有影响外，加入其它金属离子后探针的荧光光谱相对变化都很小，说明此探针对这些金属离子没有识别响应。同时，实验考察了探针分子RG1识别Cu2+时受其它金属阳离子干扰的情况。从图2(B)可以看出，在不同金属离子选择性实验的体系中，再加入一定浓度的Cu2+都能引起荧光强度的大幅度增加，说明这些离子不干扰探针分子对Cu2+的特异性识别。结果表明，探针分子RG1对Cu2+有良好的选择性。

图2 (A) 探针RG1对金属离子的选择性(探针RG1的浓度为10 μmol/L,金属离子的浓度均为50 μmol/L);(B)其他金属离子和Cu2+(50 μmol/L)共存时探针RG1荧光强度的变化Fig.1 (A) Fluorescence response of probe RG1(10 μmol/L) to different metal ions(50 μmol/L);(B) Fluorescence intensity changes of RG1 upon the addition of various metal ions in and without the presence of Cu2+

2.3 Cu2+浓度对探针分子荧光光谱的影响

为了进一步考察探针分子RG1荧光强度变化与Cu2+浓度之间的关系，在相同的乙腈-水溶液体系中进行了Cu2+荧光滴定实验，结果如图3所示。由图3可见，随着Cu2+浓度的逐渐增大，探针分子RG1在553 nm处的荧光强度不断增强，当Cu2+浓度增大到6倍时，探针的荧光强度接近饱和。Cu2+浓度在3.0×10-6～1.5×10-5mol/L范围内与探针荧光发射强度(553 nm)呈良好的线性关系，线性回归方程为：y=8.84x+7.43，相关系数R2=0.9910。Cu2+检出限(S/N=3)为3.31×10-7mol·L-1。上述结果表明，探针RG1可以定量检测此范围内Cu2+的含量，灵敏度较高。

2.4 pH对探针分子荧光光谱的影响

考察了不同pH体系探针分子的荧光光谱。由图4可见，在未加入Cu2+时，在pH=4～10范围内几乎探测不出明显的荧光信号，说明在此范围内对体系pH变化不敏感。另外，评估了加入Cu2+后，pH对探针RG1荧光光谱的影响，发现在pH=5～10范围内，探针的荧光强度明显增大，以上结果表明，此探针可在较宽的pH范围内直接检测Cu2+的浓度。

图3 逐渐加入Cu2+(0～80 μmol/L)为探针RG1(10 μmol/L)的荧光发射光谱图Fig.3 Fluorescence emission spectra of probe RG1 in the presence of Cu2+ with concentration increased[Cu2+]：a-n:0-80 μmol/L；[RG1]=10 μmol/L.

图4 pH对探针RG1荧光强度(λem=553 nm)的影响Fig.4 Eeffect of pH on the fluorescence intensity(λem=553 nm) of probe RG1(a) free probe RG1(10 μmol/L);(b) probe RG1+Cu2+.[Cu2+]=50 μmol/L;Excitation at 510 nm.

2.5 探针识别机理探讨

为了了解探针RG1对Cu2+的识别机理，考察了EDTA对探针RG1和Cu2+作用体系荧光光谱的影响。发现当向探针识别Cu2+的体系中加入过量的EDTA时，荧光光谱的变化很小，表明Cu2+的识别过程不可逆。此外，通过HRMS对探针识别Cu2+的溶液进行测试，发现生成了探针RG1的水解产物，[M+H]+计算值：415.2022,实测值：415.2015。由此可以进一步证明探针RG1对Cu2+的识别机理[18]为探针分子中识别部位氮原子和氧原子先与Cu2+键合引起探针分子螺内酰肼开环，然后进一步水解生成化合物R1，从而诱导荧光明显增强，如图5所示。

图5 探针RG1识别Cu2+的机理Fig.5 Proposed mechanism of probe RG1 detecting Cu2+

2.6 样品检测及加标回收试验

取河水水样，按实验方法测定其荧光强度，并进行加标回收试验，结果如表1，平均回收率为100.7%，相对标准偏差(RSD)为2.3%。因此，该方法具有较好的准确度和精密度。

表1 水样中Cu2+的检测(n=5)

3 结论

合成了一种新的荧光增强型Cu2+荧光探针。在荧光探针RG1的水溶液中，加入Cu2+后会引发探针螺环开环，然后发生水解，导致荧光明显增强。方法检测Cu2+的灵敏度高、选择性好，检出限为3.31×10-7mol/L，而且，探针可以在比较宽的pH范围内对Cu2+实施检测。