张 磊， 黄慧玲， 杨 昂， 张 茜， 郑春红， 朱玉华， 刘松麟， 李印淑

（亚能生物实验室，广东 深圳 518102）

循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）检测对于肿瘤的早期发现、临床诊断、病情监测等具有重要意义，但CTC在肿瘤患者外周血中极为稀少，约为1～10个/mL，而正常成人外周血中血细胞数量为109个/mL，白细胞的数量是（4～10）×106个/mL[1-2]。CTC远低于血液中其他类型的细胞，数量的稀少使得血液CTC检测极具挑战性，加上CTC产生的复杂性、异质性，更增加了其检测的难度[3-4]。因此，如何从数量庞大的背景血液细胞中准确地富集出几个CTC，是CTC检测技术需要解决的关键问题。本研究利用免疫磁珠和免疫荧光技术，建立一种高效、不依赖肿瘤细胞表面标志物、不依赖于肿瘤细胞大小的CTC阴性富集方法和免疫荧光鉴定方法。

1 材料和方法

1.1 材料和仪器

宫颈癌细胞系SiHa（中国科学院细胞库），活细胞荧光染料Celltracker CMFDA（美国Thermo Fisher公司）、Hoechst33342[生工生物工程（上海）有限公司]，荧光显微镜（日本尼康公司）。CTC阴性富集与免疫荧光鉴定试剂由亚能生物技术（深圳）有限公司自主研发，其中试剂A主要包括缓冲液、白细胞去除磁珠；试剂B主要包括细胞固定液、细胞透化液、封闭液、抗体稀释液、抗体浓缩液Ⅰ（含CK-异硫氰酸荧光素）和Ⅱ（含CD45-藻红蛋白）、含DAPI抗淬灭封片剂等。

1.2 方法

1.2.1 细胞计数与掺入 将SiHa细胞加入Celltracker CMFDA染色，用血球计数板精确计数至固定体积内含有6、9、15、30、90、300个不同数量梯度的细胞，并掺入3 mL全血中，每组设6个组内平行。

1.2.2 CTC阴性富集及免疫荧光鉴定 按照CTC阴性富集与免疫荧光鉴定试剂盒说明书进行操作。……