韩东

摘 要：目的：建立测定二甲双胍格列本脲胶囊中格列本脲含量的高效液相色谱-质谱联用法。方法：采用HPLC-MS仪、Xbridge C18色谱柱（4.6×75mm，2.5μm），样品经多反应监测MRM扫描模式测定格列本脲含量。结果：样品质量浓度保持在1.011～30.33μg/ml范围下表现出良好的峰面积线性关系，且监测过程中样品回收率高达99.99%，提示测定稳定性较为理想。结论：应用高效液相色谱-质谱联用法测定二甲双胍格列本脲胶囊中格列本脲含量效果显著，可提供快速、准确、灵敏的检测结果，值得在今后实际工作中作为二甲双胍格列本脲胶囊的质量控制方法。

关键词：二甲双胍格列本脲；高效液相色谱-质谱联用法；格列本脲含量测定价值

中图分类号：R927.2 文献标识码：A 文章编号：1671-2064（2018）13-0183-02

二甲双胍格列本脲胶囊作为目前针对2型糖尿病的主要治疗药物之一，是非胰岛素依赖型糖尿病的一线治疗药物，具有起效快、降糖效果好等特点。目前药品检测过程中多是通过高效液相色谱法来进行格列本脲含量的检测工作，但是该检测模式灵敏度并不理想，对于药品的定性鉴别以及含量测定也无法获得良好的测定结果[1]。本文将探讨高效液相色谱-质谱联用检测二甲双胍格列本脲胶囊中格列本脲含量的实际效果，为今后二甲双胍格列本脲胶囊质量控制工作提供切实详尽的参考依据，现报道如下。

1 儀器与试药

1.1 仪器

仪器选用Waters I Class型高效液相色谱仪（美国沃特世科技有限公司）、Waters XEVO TQ-S型三重四级杆质谱仪（美国沃特世科技有限公司）、XS205型电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）。

1.2 试药

格列本脲对照品（中国食品药品检定研究院，批号为100135-201105）、二甲双胍格列本脲胶囊（生产厂家：吉林万通药业集团，批号为160905、160906、160907，药品中格列本脲标示量为1.25mg），甲醇为色谱纯（MREDA TECHNOLOGY 批号016953）、甲酸为分析纯（MREDA TECHNOLOGY 批号017096）。

2 方法与结果

2.1 色谱与质谱条件

色谱柱选择十八烷基键合硅胶柱Waters Xbridge BEH-C18（4.6×75mm，2.5μm），流动相选择甲醇-0.1%甲酸（40：60），干燥气以及雾化气均为氮气。质谱采取电喷雾离子源、正离子进行扫描，通过多反应监测方式（MRM）行定量分析。参数设置如下：流速0.2ml/min、柱温30℃、进样量1μl；干燥器温度300℃、流量10l/min；毛细管电压4500V、喷嘴电压2000V、扫描时间0.2s。上述参数设置完成后行离子全扫描，可见格列本脲打碎并呈现出3个比较明显的二级碎片离子，该离子具备较强响应值、丰度比稳定。由此提示，上述检测模式对该类型化合物的专属性鉴别提供较为理想的数据依据[2]。

2.2 溶液制备

（1）对照品溶液：制备对照品溶液时，精密称定格列本脲对照品12.58mg置50ml容量瓶中，加入流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液待用（250μg/ml）。精密量取上述对照品贮备液5ml置于50ml容量瓶中并加入流动相稀释至相应刻度，摇匀后作为对照品溶液；（2）供试品溶液：将20粒样品内容物取出并精密称定、研细，称取上述适量细粉（约相当于格列本脲5mg）并置于100ml容量瓶中，缓慢加入流动相溶液使其稀释至刻度线，摇匀，过滤。取续滤液5ml置10ml容量瓶中，再次加入流动相稀释至刻度线并摇匀，将其作为供试品溶液；（3）阴性对照品溶液：按照质量标准中处方比例相同方法制备阴性样品，根据制备供试品溶液的方法制备法阴性对照品溶液，该阴性对照品溶液中不包含有格列本脲。

2.3 方法学考察

（1）干扰实验：分别取适量的对照品溶液、供试品溶液以及阴性对照品溶液作为实验溶液，利用HPLC-MS/MS定量离子流色谱图对上述三种溶液进行有效测定并记录相关数据，一般情况下组分出峰的区域未见干扰峰，此外阴性对照基底的响应值较低，提示处方中其他成分以及辅料未对样品的测定造成相应干扰。（2）线性关系考察：精密量取对照品贮备溶液0.5，1.0，2.5，5.0，10.0以及15.0ml，将其分别置于100ml容量瓶中并加入流动相稀释至刻度，摇匀后将其制备成格列本脲对照品系列溶液。根据拟定色谱质谱条件对其进行分析并记录定量离子总粒子流色谱图，测定过程中需以格列本脲峰面积作为纵坐标（Y轴）、格列本脲质量溶度作为横坐标（X轴），进行线性回归计算，在此基础上得到回归方程Y=100789X-900.0，r=0.9997（n=6）。分析该线性回归方程计算结果可知，格列本脲质量浓度保持在1.011～30.33μg/ml范围下表现出良好的峰面积线性关系。继续稀释对照品系列溶液并分析可知，于信噪比（S/N）10情况下格列本脲的质量浓度值为0.4ng/ml。（3）精密度试验：取同一对照品溶液连续进行6次进样处理，计算格列本脲峰面积，结果为RSD=0.11%（n=6），表明仪器具备有良好的检测精密度。（4）重复性试验：选取6份二甲双胍格列本脲胶囊并依次测定其含量，结果表明格列本脲含量的平均含量为97.53%，RSD为0.34%（n=6），表明了该方法具备有良好的重复性。（5）稳定性试验：取同一供试品溶液进行本次研究，将其置于室温下并分别于0，2，4，6，8，12h进行测定，应用外标法计算其含量，结果表明RSD为0.50%（n=6），这表明了供试品溶液在12h内均能够保持有良好的稳定性能。（6）加样回收试验：取20粒已知含量的二甲双胍格列本脲胶囊内容物作为试验用药，对其进行研细处理之后，分别精密称取适量的细粉（约相当于格列本脲5mg），细粉称量完成后置于25ml容量瓶中，然后分别精密加入对照品4mg、5mg以及6mg各三份，加入流动相溶解并稀释至相应刻度，摇匀后滤过处理。精密量取续滤液5ml，分别置9个100ml容量瓶，加入流动相，稀释处理至预定刻度，精密吸取1μl并测定，在此基础上计算格列本脲加样回收率[3]，具体的计算结果如表1所示。

2.4 样品的含量测定

对样品中格列本脲的含量进行测定的过程中，需选取3批二甲双胍格列本脲胶囊作为试验材料，根据相应标准同法制备测定供试品溶液，进样1μl之后进行测定，测量并记录离子离子流色谱图，再根据外标法计算其含量，结果批次编号分别为1，2，3的样品含量分别为标示量的98.69%、98.68%以及98.22%，这也就表明了该样品中的样品含量达到了预定的标准[4]。

3 讨论

3.1 色谱以及质谱条件的选择

本次研究中选择甲醇-0.1%甲酸（40：60）作为流动相，发现当应用此流动相时所能够获取的理论板数是最高的，质谱响应值也相对更高，具体的理论板数甚至还能够达到6000以上。因此提示，在具体的检测过程中可直接将甲醇-0.1%甲酸（40：60）流动相作为检测的条件，并能够在此基础上进行二级质谱的不断优化与完善。只有在合理的色谱以及质谱条件选择基础上才能够使格列本脲获得较为稳定的碎片离子，从而取得一个良好的检测效果。

3.2 各国的药典对比

就格列本脲的含量测定方式进行研究，在中国药典、日本药典以及欧洲药典中，均采用HPLC法以及滴定法来对格列本脲的含量进行测定。其中在应用HPLC法来进行测定的过程中，HPLC流动相分别为磷酸二氢铵溶液（取1.725g硫酸二氢铵加水300ml溶解，之后用磷酸调节pH值，直到其pH值达到3.5）-甲醇（3：5）以及1.36%磷酸二氢铵溶液（具体制法同上，其中pH值应用磷酸调节到3.0）-乙腈（53：47）。但是在液质联用法中仅可将挥发性成分作为流动相，因此在具体检测过程中也就存在有比较多的限制性。較之于各国药典中的记载，本研究中所选取的测定模式更加适用于液质联用法的测定，在对格列本脲进行测量的过程中具备更高的准确性以及灵敏度。

3.3 方法评价

本次研究所涉及的色谱系统及质谱系统测定二甲双胍格列本脲胶囊中格列本脲含量具有理想的应用效果，并能够为该类型制剂今后的分析、开发、代谢动力学研究等工作提供重要的参考价值。

参考文献

[1]关金龙.高效液相色谱-质谱联用法在分析检测中的运用分析[J].机电信息，2015，（5）：40-42.

[2]蓝际荣，杨安平，吴来燕，等.基于固相萃取/高效液相色谱-质谱联用法的微囊藻毒素代谢产物制备及应用[J].分析测试学报，2015，（6）：664-669.

[3]刘信奎，王萌萌，张连成，等.高效液相色谱-质谱联用法测定二甲双胍格列本脲胶囊（Ⅰ）中格列本脲含量[J].中国药业，2017，（6）：25-27.

[4]谢强胜，张子璇，张中湖，等.超高效液相色谱法测定唐解胶囊中非法添加降糖类化学药物[J].药学研究，2017，（4）：200-202.