薛阿辉，崔 萌，邹华杰，罗丽萍,2,*

桂花（Osmanthus fragrans Lour.）属木犀科木犀属（Osmanthus），是中国特有的常绿阔叶灌木或小乔木经济树种。除供观赏外，其根、花和果实也具有药用价值[1-2]。桂花还是传统的食品，富含氨基酸、优质植物蛋白和铁、锌等人体必需的微量元素，香浓味甜，营养丰富，被称为“全营养食品”[3-4]。

目前有关桂花芳香成分的报道较多。研究表明，桂花含有α-紫罗兰酮、β-紫罗兰酮、芳樟醇氧化物、芳樟醇、γ-癸酸内酯、二氢-β-紫罗兰酮、壬醛、（Z）-β-罗勒烯和β-蒎烯等芳香物质[5-7]。从桂花醇提液中鉴定出了苯丙素苷、环烯醚萜苷、苯乙醇苷、木脂素类和酚酸类物质[8-13]。总体来看，对桂花多酚类化合物的系统研究相对较少。多酚类化合物是一类广泛存在于植物中的多羟基酚类化合物，具有良好的抗癌、抗氧化、抗衰老等生物活性，目前的分析方法主要有高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）、液相色谱-质谱联用和核磁共振。

电喷雾萃取电离质谱（extractive electrospray ionization-mass spectrometry，EESI-MS）技术是一种新兴的离子化技术，可对复杂基体样品进行直接快速质谱分析，适用于分析液体、气溶胶、固体表面和黏性样品等不同形态的样品[14]，已应用于蜂蜜中化学污染物[15]、莲子中生物碱[16]和脐橙中氨基酸、糖类和生物碱[17]等的研究。

为建立桂花中多酚类化合物的EESI-MS分析法，本实验以四季桂花为实验材料，首先采用分光光度法测定其总酚、总黄酮含量，在采用HPLC法了解其多酚类化合物组成的基础上，采用EESI-MS分别在正、负离子模式下分析四季桂花醇提液中的原儿茶酸、p-香豆酸、咖啡酸、表儿茶酸、绿原酸、肉桂酸、桑黄素和杨梅素8 种化合物。研究可为多酚类化合物的分析提供一定数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

桂花为四季桂，2016年10月采于南昌大学前湖校区。样品于60 ℃烘干至恒质量，保存于干燥器中备用。

没食子酸、杨梅素、阿魏酸、绿原酸、咖啡酸、山柰酚、（＋）-儿茶素、p-香豆酸等标准品（纯度≥98%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；肉桂酸、柚皮素、槲皮素等标准品（纯度≥98%）中国固体制剂制造技术国家工程研究中心；桑黄素、表儿茶素、木犀草素、原儿茶酸、芦丁等标准品（纯度≥98%） 中国药品生物制品检定所；橙皮苷、白藜芦醇等标准品（纯度≥98%） 北京百灵威科技有限公司；无水乙醇（分析纯）、甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）和甲酸（优级纯）均为国产市售。

1.2 仪器与设备

Alliance HPLC仪 美国Waters公司；C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、EESI离子源由江西省质谱科学与仪器重点实验室研制；LTQ-XL线性离子阱质谱仪美国Finnigan公司；FA2204B电子天平 上海精科天美科学仪器有限公司；KQ3200DE型数控超声清洗器昆山市超声仪器有限公司；Hitech-Master综合型超纯水机 上海和泰仪器有限公司；TDL-5-A台式低速大容量离心机 上海安亭科学仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 桂花醇提液的制备

参照Tsai等[18]的方法，干燥桂花用研钵研磨成粉后，称取干粉0.500 g，加入70%甲醇溶液7.5 mL，50 ℃超声提取30 min，4 000 r/min离心10 min，收集上清液，残渣重复提取1 次，合并上清液，定容至500 mL，获得四季桂花醇提液。

1.3.2 总酚、总黄酮含量的测定

1.3.2.1 总酚含量的测定

参照文献[19-21]，以没食子酸为标准品，采用Folin-Ciocalteu法测定总酚含量。没食子酸标准曲线绘制：精密称取干燥至恒质量的没食子酸，用超纯水溶解，配制成质量浓度分别为0.015 6、0.031 3、0.062 5、0.125 0、0.250 0 mg/mL的标准液，分别准确吸取1 mL各质量浓度标准液于25 mL容量瓶中。加入3 mL的Folin-Ciocalteu试剂，再加入2 mL 200 g/L的碳酸钠溶液，混匀后用蒸馏水定容，70 ℃水浴15 min，室温冷却后，于760 nm波长处测定各管吸光度，以吸光度为横坐标、没食子酸终质量浓度为纵坐标绘制标准曲线，以没食子酸空白溶液作对照。

样品测定：准确吸取20 μL四季桂花醇提液于25 mL容量瓶中，其他步骤同上。通过没食子酸标准曲线回归方程计算总酚含量。实验重复3 次，结果以没食子酸的质量计，以 ±s表示。

1.3.2.2 总黄酮含量的测定

以芦丁为标准品，采用铝盐显色法测定总黄酮含量。芦丁标准曲线绘制：精密称取干燥至恒质量的芦丁标准品0.005 0 g于25 mL容量瓶中，用无水乙醇溶解并定容，配成0.2 mg/mL的标准溶液。分别准确吸取0.1、0.2、0.8、1.6、3.2 mL和6.4 mL的标准液于25 mL容量瓶中，加入无水乙醇至10 mL。各瓶中分别加入100 g/L氯化铝溶液0.5 mL，混匀后用蒸馏水定容，室温静置15 min后，于415 nm波长处测定各管吸光度，以吸光度为纵坐标、芦丁终质量浓度为横坐标绘制标准曲线，以芦丁空白溶液作对照。

样品测定：准确吸取待测样品50 μL于25 mL容量瓶中，其他步骤同上。通过芦丁标准曲线线性回归方程计算样品中总黄酮含量。实验重复3 次，结果以芦丁的质量计，以 ±s表示。

1.3.3 HPLC法测定桂花中的15 种多酚类化合物

色谱柱：Symmetry C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）和0.5%甲酸溶液（B）；流速1 mL/min；柱温35 ℃；检测波长280 nm和320 nm；进样量20 μL。采用梯度洗脱[22]：0～5 min：5%～14% A；5～20 min：14%～21% A；20～27 min：21%～27% A；27～40 min：27%～42% A；40～48 min：42%～65% A；48～54 min：65%～35% A；54～60 min：35%～14% A；60～62 min：14%～5% A。

原儿茶酸、（＋）-儿茶素、表儿茶素、桑黄素、槲皮素和柚皮素的混合标准品溶液在280 nm波长下检测；绿原酸、p-香豆酸、芦丁、阿魏酸、橙皮苷、杨梅素、白藜芦醇、肉桂酸和木犀草素的混合标准品溶液在320 nm波长下检测。利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）进行分析，设定参照谱图，将谱图自动匹配生成对照图谱进行相似度评价，依据保留时间及紫外吸收光谱定性；半定量分析根据标准品和样品的浓度与峰面积之间的比例关系计算。

1.3.4 EESI-MS检测条件

线性离子阱质谱（line iron trap-mass spectrometry，LTQ-MS）为正、负离子检测模式，质谱扫描范围m/z 50～800；离子传输管温度150 ℃；ESI溶剂为甲醇；雾化气为氮气（纯度99.999%），压力为1.2 MPa；ESI溶剂和样品流速分别为4、5 μL/min；两喷雾口之间的距离0.1 cm，夹角60°，距质谱口0.5 cm，角度为150°；测定时的实验条件：萃取剂为甲醇，电喷雾电压3.5 kV，母离子的隔离窗口宽度设定为1.0 Da，碰撞时间为30 ms，碰撞能量17%～25%，其他参数由LTQ-MS软件系统自动优化[23]。EESI-MS检测到的化合物定性是通过比对实验得到的精确质量与Pub Chem数据库中串联质谱信息及标准品谱图确定。

将HPLC检测的15 种多酚类化合物标准品配制成500 μg/L的混合标准品溶液，分别在正、负离子模式下进行EESI-MS2扫描，选择m/z 153、163、179、289、353、149、303、319进行碰撞诱导解离实验，获得二级质谱图。

2 结果与分析

2.1 四季桂花总酚、总黄酮含量结果

没食子酸和芦丁标准曲线回归方程分别为：y=116.64x＋0.022 5（R2=0.991 8）；y=29.176x-0.000 3（R2=0.999 5）。四季桂花醇提液中总酚和总黄酮含量分别为（133.38±0.12）mg/g和（72.49±0.09）mg/g。Chen Guanlin等[24]采用超高效液相色谱法测定金盏花中总酚和总黄酮含量分别为（13.03±0.24）mg/g和（3.03±0.08）mg/g；蜡梅中总酚和总黄酮含量分别为（25.77±0.10）mg/g和（5.96±0.11）mg/g；茉莉花中总酚和总黄酮含量分别为（12.66±0.17）mg/g和（3.77±0.06）mg/g。与其他花卉相比，桂花中的总酚和总黄酮含量较高。

2.2 桂花中15 种多酚类化合物的HPLC测定结果

多酚类化合物因结构特征有两个主要吸收带，其中一个吸收带在300～400 nm区间，由B环桂皮酰系统产生，另一个吸收带在240～285 nm区间，由A环苯甲酰系统产生[25]。在256、280、320 nm三种波长下检测四季桂花醇提液，发现在280 nm和320 nm波长下出峰数量和分离效果最好。在综合考虑基线、峰形、信号响应强弱以及负峰等情况后，最终确定将标准品分为2 组，分别在280 nm和320 nm波长处检测。分组后混合标准品的分离效果较好（图1）。

图1 混合标准品在280 nm（a）和320 nm（b）波长的HPLC图Fig. 1 HPLC profile of mixed standards at 280 nm (a) and 320 nm (b)

图2 280 nm（a）和320 nm（b）波长下桂花醇提液的HPLC图Fig. 2 HPLC profiles of methanol extract from O. fragrans flowers at 280 nm (a) and 320 nm (b)

HPLC法从四季桂花中检测到了15 种多酚类化合物（图2和表1），总含量为52.438 mg/g。其中含量较高的有杨梅素、桑黄素、芦丁、柚皮素和（＋）-儿茶素。

表1 四季桂花中15 种多酚类化合物的HPLC测定结果Table 1 Determination of 15 polyphenolic compounds in O. fragrans flowers by HPLC

2.3 四季桂花醇提液EESI-MS分析

图3 正（a）、负离子（b）下四季桂花醇提液的EESI-MS图Fig. 3 Extractive electrospray ionization mass spectra of methanol extract of O. fragrans flowers in positive and negative ion modes

四季桂花醇提液的EESI-MS一级谱图见图3。混合标准品溶液在正、负离子模式下，选择m/z 153、163、179、289、353、149、303、319进行碰撞诱导解离实验，获得二级质谱图（图4）。

负离子模式下对m/z 153、163、179、289、353进行碰撞诱导解离分析。m/z 153的二级谱图中最主要的碎片离子峰为m/z 109，由母离子丢失一个CO2形成（[M-44]-），与原儿茶酸标准品（图4a）和文献[26]中关于原儿茶酸的报道一致，可以确认m/z 153为原儿茶酸；母离子m/z 163的二级谱图中最主要的碎片离子峰为m/z 119，由母离子丢失一个CO2形成（[M-44]-），与p-香豆酸标准品（图4b）和文献[27]报道一致，可以确认m/z 163为p-香豆酸；母离子m/z 179的二级谱图中最主要的碎片离子峰为m/z 135和m/z 161，是母离子分别丢失一个CO2（[M-44]-）和H2O（[M-18]-）形成，与咖啡酸标准品谱图（图4c）和文献[26]一致，可以确认m/z 179为咖啡酸；母离子m/z 289的二级谱图中最主要的碎片离子峰为m/z 245，m/z 245是母离子丢失—CH2CHOH—基团形成的碎片峰（[M-44]-），与表儿茶素标准品谱图（图4d）和文献[28]一致，可以确认m/z 289为表儿茶素；母离子m/z 353的二级谱图中最主要的碎片离子峰为m/z 191，是母离子丢失一个咖啡酰基形成的奎尼酸（[M-162]-），m/z 179是母离子丢失一个奎尼酸加一个羟基形成的咖啡酸（[M-174]-），与绿原酸标准品谱图（图4e）和文献[26]一致，可以确认m/z 353为绿原酸。

正离子模式下对m/z 149、303、319进行碰撞诱导解离实验和定性分析。母离子m/z 149的二级谱图中最主要的碎片离子峰为m/z 131 ，由母离子丢失一个H2O形成（[M-18]-），这与肉桂酸标准品谱图（图4f）一致，可以确认m/z 149为肉桂酸；母离子m/z 303的二级谱图中最主要的碎片离子峰为m/z 285，由母离子丢失一个H2O形成（[M-18]-），这与桑黄素标准品谱图（图4g）和文献[29-30]报道一致，可以确认m/z 303为桑黄素；母离子m/z 319的二级谱图中最主要的碎片离子峰为m/z 301，由母离子丢失一个H2O形成（[M-18]-），进一步丢失一个CO2形成m/z 257（[M-62]-），这与杨梅素标准品谱图（图4h）一致，可以确认m/z 319为杨梅素。

综上所述，采用EESI-MS从四季桂花醇提液中鉴定出了原儿茶酸、p-香豆酸、咖啡酸、表儿茶素、绿原酸、肉桂酸、桑黄素和杨梅素8 种多酚类化合物。

图4 8 种标准品的EESI-MS二级谱图Fig. 4 EESI-MS2 spectra of 8 standards

3 结 论

四季桂花总酚和总黄酮含量分别为（133.38±0.12）mg/g和（72.49±0.09）mg/g，分别为其干质量的13.34%和7.25%，说明其富含多酚类化合物。采用HPLC从四季桂花醇提液中检测到了15 种多酚类化合物，其中杨梅素、桑黄素、芦丁、柚皮素和（＋）-儿茶素含量较为丰富。进一步采用EESI-MS，在未经色谱分离的情况下，负离子模式下直接从四季桂花醇提液中检测出了原儿茶酸、p-香豆酸、咖啡酸、表儿茶素和绿原酸5 种化合物；正离子模式下检测出了肉桂酸、桑黄素和杨梅素3 种化合物。EESI-MS具有样品用量少、不需要色谱分离、分析速度快等优点，可用于多酚类化合物的分析。