邱模昌 徐子金 杨章坚

（江西医学高等专科学校药学系，江西 上饶 334000）

三叶青 (Tetrastigmatis hemsleyani)为葡萄科植物三叶崖爬藤的块根或全草，别名为金线吊葫芦、丝线吊金钟、三叶扁藤等[1]，为江西省道地药材。近年来，对于三叶青抗肿瘤活性研究较多，三叶青黄酮能显著地抑制肺癌A549细胞、SGC-7901胃癌细胞、及SMMC-7721肝癌细胞的生长，并且具有浓度依赖性[2-4]。三叶青乙酸乙酯提取物能有效抑制结肠癌HT-29细胞、白血病HL60细胞、颈癌Hela细胞[5-7]的增殖。三叶青乙醇提取物在一定浓度范围内能抑制恶性黑色素瘤A375细胞的增殖，且呈剂量依赖关系[8]。三叶青水提物及其含药血清对人胃腺癌细胞AGs细胞均有较强抑制作用，并且其抑制作用呈现出剂量依赖性[9]。三叶青各种方式的提取物体外抑制肿瘤作用均有报道，对其抗肿瘤活性差异尚未有具体研究。通过采取水、乙醇、乙酸乙酯三种不同的溶剂对三叶青进行提取，检测三叶青不同方式提取物的含药血清体外对乳腺癌细胞（MCF-7）存活率及凋亡的影响，根据不同提取方式对肿瘤细胞存活率及凋亡作用的差异，确定抑制肿瘤活性最强的提取方式，为明确三叶青抗肿瘤的具体成分提供依据。

1 材料

1.1 药材 三叶青购自上饶市中医院，经江西医学高等专科学校药学系汪亮副教授鉴定为Tetrastigma hemsleyanum Diels et.Gilg。

1.2 细胞 人乳腺癌细胞（MCF-7）购自上海美轩生物科技有限公司。

1.3 仪器与试药 ELX800酶标仪（美国Biotek公司），H4-2000倒置荧光显微镜（日本奥林巴斯公司），Annexin HS-1300-U超净工作台（山智精密仪器科技有限公司），MCO-18AC CO2培养箱（日本三洋公司），SY-5000旋转蒸发器（上海圣科仪器设备有限公司）。MTT(美国，Amresco公司)，RPMI 1640培养基 (美国，Invitrogen公司)，胎牛血清 (上海蓝季科技发展有限公司)，V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（南京森贝伽生物科技有限公司），水、95%乙醇、乙酸乙酯、DMSO均为分析纯。

2 方法

2.1 三叶青提取物溶液的制备 取三叶青饮片适量，分别加适量的水、95%乙醇、乙酸乙酯作为提取溶剂，回流提取3次，每次1 h，合并提取液，过滤，滤液浓缩干燥，得三叶青水提取物浸膏、乙醇提取物浸膏、乙酸乙酯提取物浸膏。取3种浸膏适量，用1 mL DMSO溶解，用含10%(体积分数)灭活新生小牛血清RPMI-1640培养液稀释，分别配制成10、50、250、500、1000 μg.mL-1溶液，备用。

2.2 细胞培养 取对数生长期的MCF-7贴壁细胞制成1×104个·mL-1单细胞悬液，接种于96孔培养板，每组设6个平行孔，每孔100 μL，24 h后吸弃原培养基，换用含1%胎牛血清的DMEM培养备用。

2.3 MTT法检测三叶青提取物对MCF-7细胞存活率的影响

2.3.1 3种不同浓度提取物对存活率的影响 将备用MCF-7细胞分成6组，设对照组和实验组。对照组培养基不加任何药物；实验组分别加入不同浓度三叶青水提取物溶液、乙醇提取物溶液、乙酸乙酯提取物溶液，使其终浓度分别为2、10、50、100、200 μg·mL-1。上述各组细胞培养24 h后，加入5 mg·mL-1浓度MTT溶液每孔15 μL，孵育4 h后吸弃上清。每孔加入DMSO 150 μL，室温下放置30 min，振荡5 min，使结晶物充分溶解，选择490 nm波长，在酶标仪上测定吸收值，记录OD值为结果。

2.3.2 3种提取物对MCF-7细胞凋亡的影响 采用流式细胞Annexin V-FITC/PI双染法检测MCF-7细胞凋亡率。将备用MCF-7细胞分成4组，分别是：①对照组：培养基不加任何药物；②水提物组：加入三叶青水提取物溶液，使其终浓度为200 μg·mL-1；③乙醇组：加入三叶青乙醇提取物溶液，使其终浓度为200 μg·mL-1；④乙酸乙酯组：加入三叶青乙酸乙酯提取物溶液，使其终浓度为200 μg·mL-1。上述各组培养24 h后采用不含DMEM的0.25%胰酶消化收集细胞，用PBS洗涤细胞2次，1000 r·min-1离心5 min，吸弃上清液，然后加入400 μL结合缓冲液重悬细胞。分别加5 μL Annexin VFITC和5 μL PI避光反应10 min，立即用FACScan进行流式细胞术定量检测， FITC+/PI-的细胞为凋亡细胞，凋亡细胞占总细胞数为细胞凋亡率。

2.4 统计学方法 采用SPSS 13.0软件进行统计分析，计量资料用（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，检验水准取α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 不同浓度三叶青提取物对MCF-7细胞存活率的影响 3种不同提取物，以各自对照组OD值为标准，对应存活率为 (100±0)%，实验组按照OD值与对照组OD值比值计算其相对存活率。经MTT法检测细胞存活率发现，三叶青的水、乙醇、乙酸乙酯提取物溶液，除低浓度（2 μg·mL-1、10 μg·mL-1）水提取物外，均能使MCF-7细胞存活率下降（P<0.05），且其对存活率的降低作用与提取物浓度成正相关；相同浓度下，3种提取物对MCF-7细胞存活率的降低作用依次是乙酸乙酯提取物>乙醇提取物>水提取物（见表1、图1）。

表1 不同浓度、不同提取方式三叶青提取物对MCF-7细胞存活率的影响 （，%）

表1 不同浓度、不同提取方式三叶青提取物对MCF-7细胞存活率的影响 （，%）

注：与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；n=6

提取物浓度（μg·mL-1）0（对照组）2 10 50 100 200 MCF-7细胞存活率水提取物溶液 乙酸乙酯提取物溶液乙醇提取物溶液100±0 89.82±2.04 91.74±1.98 85.15±3.52 76.45±3.60 75.20±4.26 100±0 75.74±3.54 65.32±4.21 64.06±4.86 58.29±4.77 54.47±5.91 100±0 77.04±4.19 70.60±4.73 60.42±5.10 45.61±5.45 40.33±6.49

图1 不同浓度、不同提取方式三叶青提取物对MCF-7细胞存活率的影响

3.2 不同三叶青提取物对MCF-7细胞凋亡的影响 采用流式细胞Annexin V-FITC/PI双染法对三叶青的水、乙醇、乙酸乙酯3种提取物在高浓度（200 μg·mL-1）下影响MCF-7细胞凋亡的效果进行了检测。结果显示水提物组、乙醇组较对照组细胞凋亡率明显提升（P<0.05）；乙酸乙酯组较对照组细胞凋亡率显著提升（P<0.01）；乙酸乙酯组较水提物组、乙醇组，前者具有更强的促进MCF-7细胞凋亡的作用（P<0.05），见表2。

表2 不同三叶青提取物对MCF-7细胞凋亡的影响

4 讨论

江西省中草药资源丰富，通过对中草药提取成分的研究有利于充分发掘中药治疗肿瘤的潜在作用。为中药抗肿瘤作用提供科学、客观的理论依据。三叶青作为近年研究较多的抗肿瘤中药材之一，其体内外抑制肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、黑色素瘤等均有报道。乳腺癌是全世界女性最常见的恶性肿瘤，在我国乳腺癌发病率也居女性恶性肿瘤之首，且仍在快速增长[13]。研究结果显示，三叶青3种提取方式的提取物，在较高浓度（50 μg·mL-1）下，共同培养24 h，均能不同程度地降低MCF-7细胞存活率，在高浓度（200 μg·mL-1）下，能使MCF-7细胞早期凋亡率明显提高。这说明3种提取方式的三叶青提取物均具有体外抗乳腺癌MCF-7细胞作用，其机制可能与促进癌细胞凋亡有关。

三叶青的主要有效成分包括黄酮类、三萜及甾体类、酚酸类、脂肪酸类化合物等，其中黄酮类成分为主要抗肿瘤活性成分[14]。不同浓度三叶青提取物对MCF-7细胞存活率的影响结果中发现，3种提取物在50 μg·mL-1（或更高）浓度下，对癌细胞的抑制作用呈现出较大差距，其中乙醇提取物和乙酸乙酯提取物对MCF-7细胞的抑制作用要高于水提取物。在50 μg·mL-1（或更高）浓度下，乙酸乙酯提取物的作用又明显强于乙醇提取物。3种高浓度（200 μg·mL-1）三叶青提取物对MCF-7细胞凋亡的影响均有较大的差异，对细胞凋亡的影响乙醇提取物>乙醇提取物>水提取物。这说明三叶青的乙酸乙酯提取物是三种提取物中抗肿瘤作用最强的。三叶青乙酸乙酯提取物中具体抗肿瘤的成分及作用机制还有待进一步研究。