汪德培，陈建锋，李 欢，赵 钢，何晓东，褚家如

(1.中国科学技术大学 精密机械与精密仪器系，安徽 合肥 230027；2.中国科学技术大学附属第一医院，安徽 合肥 230001)

循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells, CTCs)是指从原发肿瘤扩散进入外周循环血液系统中的肿瘤细胞，CTCs的检测对于癌症的诊断和治疗具有重要意义[1]，但由于其数量极其稀少，10 mL血液中CTCs的数目仅为1～10个，因此在临床上必须从肿瘤血液样品中分选出CTCs。目前，CTCs分选方法主要有基于物理性质和基于化学性质两大类[2]，其中，基于物理性质的过滤法利用癌细胞与正常体细胞物理大小和变形能力的区别来实现分选，这种方法因具有操作简单、捕获效率高和成本低等特点而受到广泛关注。

目前，很多物理过滤法能够实现CTCs的高效捕获[3-5]，但却无法将捕获到的CTCs从过滤芯片中释放出来，以用于进一步研究，或者释放流程复杂、成本高，这主要是由于CTCs细胞膜表面的蛋白质与过滤芯片材料表面产生了较强的粘附力。影响这种粘附力的因素主要有材料的表面形貌、亲疏水性、表面基团及电负性等[6]。本文使用的氮化硅过滤膜与CTCs之间也存在这种粘附力，从而导致癌细胞难以取出，且污染过滤膜。

Y. J. Kim[7]等通过在过滤膜表面涂覆poly(ethylene glycol) (PEG)，大大提高了过滤膜表面的亲水性，从而减弱了细胞与过滤膜之间的粘附力，提高了癌细胞释放效率。Zheng A.[8]等通过在过滤膜表面涂覆一层热敏性水凝胶poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)，其最低临界相变温度为32 ℃，当环境温度高于此温度时，过滤膜表面疏水，易于粘附癌细胞；若低于此温度，水凝胶结构发生变化导致过滤膜表面由疏水转为亲水，从而减弱了癌细胞与表面的粘附力，提高了释放效率。目前，这些释放方法工艺流程复杂、操作繁琐、成本相对较高，且不通用。由于本文使用的是超薄氮化硅栅形孔过滤膜，材料特殊且强度较弱，上述方法均不适用。

本文利用微纳加工技术加工出栅形孔氮化硅过滤膜，并用聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片和亚克力板封装成过滤装置，利用物理过滤实现了癌细胞的高效捕获。通过在过滤样品和反向冲击液中加入适量浓度的抗凝剂肝素，大大降低了癌细胞与过滤膜之间的粘附力，显著提高了癌细胞从过滤膜上的释放效率，而且释放出来的癌细胞具有活性。这样既保证了释放出的癌细胞可用于进一步研究，又能满足了过滤膜可重复利用的要求。

1 过滤装置的设计与加工

1.1 过滤膜的设计与加工

本文在前期研究中[9]，设计了一种栅形孔型结构，经过计算分析可知，在孔隙率和压差相同的情况下，栅形孔的通量是圆形孔的接近2倍。而高通量是临床上分选CTCs的一个重要指标，因此栅形孔结构具有明显优势。

在此基础上，本文采用如图1所示的微纳加工工艺来加工过滤膜。硅片经过化学气相沉积、光刻、反应离子刻蚀、深硅刻蚀和湿法刻蚀等流程形成栅形孔过滤膜。过滤膜的材料为氮化硅，它是微机电系统(MEMS)技术中的一种重要材料，具有较好的化学稳定性、硬度和光学特性[10-11]。

图1 过滤膜工艺流程图

加工完毕的过滤膜如图2所示。尺寸为20 mm×20 mm，中间栅形孔区域尺寸为6 mm×6 mm，厚度为500 nm，栅形孔的长为100 μm，宽度有5、6、7和8 μm等4种。

图2 栅形孔氮化硅过滤膜

1.2 微流控芯片的封装

本文采用购买自道康宁公司、型号为DC184的聚二甲基硅氧烷(PDMS)来加工微流道。PDMS是一种常见的热塑性弹性体,其具有如下优点：1)稳定的物理和化学性质，良好的力学性能，易于加工，可多次使用；2)良好的光学性能，透光性好，可实时观察；3)生物兼容性好，可用于细胞培养。

微流道的加工采用常用的复制压模法，具体流程如下：1)将PDMS和固化剂按10∶1的质量比配制成预聚物，并搅拌均匀；2)利用真空干燥箱除去气泡；3)将预聚物浇铸到已加工好的模具上，在65 ℃热板上加热2 h；4)将固化好的PDMS芯片揭下，即可形成一个与模具图案相反的流道腔体，将氮化硅过滤膜嵌入PDMS芯片中的腔体中，上下PDMS通过自然粘附力实现初步密封，然后利用上下亚克力板通过铜柱固定，保证过滤装置的密封性。装配好的过滤装置如图3所示。

与≥18岁~30岁者比较,p<0.05;与31岁~40岁者比较,p<0.05;与>41岁~50岁者比较,p<0.05;与>50岁者比较,p<0.05;与小学及以下文化程度比较,p<0.05;与无献血史者比较,p<0.05;3讨论

图3 过滤装置

2 癌细胞的捕获与释放

2.1 试验样品、参数和方法

本文采用MDA-MB-231乳腺癌细胞来进行试验。首先通过胰蛋白酶消化培养皿中的癌细胞，使其悬浮；细胞悬浮液经离心后，吸走上层液体，加入适量培养基于细胞沉淀物中形成细胞悬浮液；吸取1 μL悬浮液于载玻片上并用荧光显微镜进行计数，细胞浓度约为1 500～2 000个/μL；取2 μL细胞悬浮液于2 mL磷酸缓冲盐溶液(PBS)中，即形成过滤样品。

本文在前期研究和试验的基础上，选择栅形孔宽度为7 μm的过滤膜，流速为0.2 mL/min来进行过滤试验。过滤时通过注射泵推动注射器完成，每次先过滤2 mL混合均匀的癌细胞悬浮液样品，然后再用1 mL PBS进行过滤清洗，结束后，将过滤膜取出放在倒置荧光显微镜下观察。反向冲击释放癌细胞时，直接将过滤装置倒置，从反方向用2 mL PBS冲击，用培养皿收集冲击出来的癌细胞。

2.2 癌细胞的捕获与反向冲击释放

在上述试验参数和方法下进行癌细胞的过滤试验，过滤膜捕获了癌细胞后的荧光视场图如图4a所示；过滤膜在经过简单的反向冲击释放后的荧光视场图如图4b。

图4 释放前、后过滤膜上的癌细胞荧光视场图

2.3 捕获与释放结果分析

经过多次反复试验，并统计过滤样品中和过滤膜上捕获的癌细胞，计算得栅形孔氮化硅过滤膜的捕获效率能达到85%。

对比图4a和图4b可以发现，将捕获了大量癌细胞的过滤膜利用PBS进行简单的反向冲击后，仍有大量癌细胞残留在过滤膜上，经统计，释放效率只有约35%，大量残留的癌细胞会堵塞过滤膜上的栅形孔，导致过滤膜无法重复利用。

较低的释放效率主要是由于癌细胞细胞膜上的蛋白质与氮化硅过滤膜之间的粘附力导致的。研究表明，这种粘附力主要受如下因素影响。

1)材料表面的亲疏水性。一般细胞膜具有一定的亲水性，亲水性的材料表面更易与细胞产生粘附，但亲水性极强的材料表面反而不易与细胞产生粘附。

2)材料表面的电负性。一般情况下，哺乳动物细胞膜表面带有一定的负电荷。一般认为，带正电荷的材料表面由于静电吸附易产生粘附，带负电荷的材料表面由于静电排斥而不易产生粘附。

因此，要提高被捕获癌细胞的释放效率，应降低癌细胞与过滤膜之间的粘附力。其可以通过采用特定亲疏水性的材料、使材料表面带负电、使材料表面尽量光滑等途径来实现。

3 肝素对癌细胞释放效率的影响

3.1 试验材料与方法

肝素是一种常用的抗凝剂，是由2种多糖交替连接而成的多聚体，具有带强负电荷的理化特性，能干扰血凝过程的许多环节，在体内外都有抗凝血作用。研究发现，肝素能在一定程度上抑制细胞粘附分子的表达，从而降低细胞的粘附力[12]。

过滤前，将过滤膜在肝素溶液中浸泡2 h，过滤样品为加入癌细胞和一定浓度的肝素溶液的PBS；试验时，首先过滤2 mL过滤样品，再用1 mL PBS冲击；释放时，将过滤装置倒置，用肝素浓度相等的2 mL PBS反向冲击。

3.2 肝素对癌细胞释放效率的影响

本文在过滤样品及反向冲击液中加入等量相同浓度的肝素，在过滤和释放后，分别用显微镜进行观察，效果如图5所示。

图5 释放前、后过滤膜上的癌细胞明场图

对比图5a和图5b发现，通过加入肝素，释放效率明显提升，释放后过滤膜上残余的癌细胞很少，可重复使用。

本文继续研究了不同肝素浓度对癌细胞释放效率的影响，分别用10、20、30、40 和50 μg/mL等5种浓度的肝素进行过滤和释放，各种肝素浓度下的释放效率如图6所示。

图6 肝素浓度对癌细胞释放效率的影响

由图6可知，未使用肝素时，癌细胞的释放效率约为30%；使用了肝素后，释放效率均在80%以上，释放效率大大提高，并且当肝素浓度为30 μg/mL时，释放效率最高，达到90%以上。

因此，通过加入肝素，可以降低癌细胞与氮化硅过滤膜表面之间的粘附力，提高癌细胞释放效率和过滤膜可重复利用性，并且在肝素浓度为30 μg/mL时效果最佳。

3.3 肝素对癌细胞活性的影响

通过在过滤样品和反向冲击液中加入适量浓度的肝素，实现了被捕获癌细胞的高效释放，但应保证释放出来的癌细胞具有活性，可用于后续的试验研究。

本文通过离心管收集反向冲击释放出来的癌细胞，采用3 000 r/min的转速离心5 min后，吸去上层清液，加入培养基后利用LIVE/DEAD染色试剂染色30 min，然后在荧光显微镜下观察，效果如图7所示。

图7 肝素对癌细胞活性的影响

图7中箭头所指向的荧光为死细胞，其他荧光为活细胞，经统计多个视野中的死、活癌细胞数目，计算得癌细胞的存活率为98%，说明在样品中加入肝素对癌细胞的活性几乎没有影响。

4 结语

本文利用微纳加工技术，加工出了栅形孔氮化硅过滤膜，实现了癌细胞的高效捕获。为了进一步将捕获的癌细胞取出用于后续试验，在分析了癌细胞与过滤膜之间粘附现象的影响因素之后，通过在过滤样品和反向冲击液中加入肝素，明显降低了癌细胞与过滤膜之间的粘附力，显著提高了癌细胞的释放效率和过滤膜的可重复利用性；同时释放出来的癌细胞具有活性。该方法具有操作方便、成本低和通用性强等特点，在临床上具有潜在应用价值。