梅海军，刘建明

南通大学附属医院普通外科，南通 226001

肿瘤干细胞(cancer stem cells, CSCs)是指肿瘤组织中一小部分亚群细胞，具有极强的成瘤能力，是肿瘤发生、发展及转移的基础[1-2]。深入研究CSCs的生物学特性，探讨调控CSCs的生物学行为机制，能够为肿瘤的临床治疗提供新的参考依据。肿瘤细胞悬浮成球实验被认为是获取肿瘤干细胞的方法之一。

悬浮球培养法已在许多实体肿瘤中成功分离出肿瘤干细胞，但该方法能否成功培育出胃癌肿瘤干细胞仍不明确。因此，本研究选用胃癌细胞株MKN45在无血清干细胞培养基中进行悬浮培养，从中分离出悬浮球细胞，检测悬浮球细胞干细胞标志物ATP结合盒蛋白亚家族2(ATP-binding cassette sub-family G member 2, ABCG2)的表达情况，探讨悬浮球培养法制备ABCG2阳性表达胃癌肿瘤干细胞的可行性。

1 资料与方法

1.1 主要材料及试剂 人胃癌细胞株MKN45购自中国科学院上海生命科学院细胞库，青霉素/链霉素购于Thermo公司，人成纤维细胞生长因子2(FGF-2)及表皮生长因子(EGF)购自Sigma公司，ABCG2抗体购自Abcam公司，RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、4×蛋白上样缓冲液、1.5 mol/LTris-HCl pH 8.8、1 mol/LTris-HCl(pH 6.8)、TEMED、增强型化学发光试剂盒均购自碧云天公司；甘氨酸(电泳级)、过硫酸胺(APS)均购自Sigma-Aldrich公司。RNA提取试剂试剂盒(RNAiso Plus)购自TaKaRa公司，MultiScribe Reverse Transcriptase购自Applied Biosystems公司；SYBRGreen PCR Supermix购自Bio-Rad公司，Diethypyrocarbonate(DEPC)水购自碧云天公司。

1.2 胃癌细胞培养 MKN45细胞培养在37℃、含5% CO2的环境中，培养液均为RPMI 1640培养基，含10%胎牛血清(FBS)，以及青霉素62.5 mg/L、链霉素100 mg/L，添加人FGF-2浓度20 ng/mL及EGF浓度100 ng/mL。细胞生长于T-75组织培养曲颈瓶中，2 d更换培养基1次，观察悬浮球形成状态，每孔约100个细胞，14 d后在显微镜下放大40及100倍观察悬浮球形成情况。悬浮球长到约300～600个细胞时，用滴管将球体吹开，细胞密度约为1 000/mL。在96孔低吸附板中，每孔加入100 μL单细胞悬液，14 d后观察悬浮球形成状态，原代贴壁培养细胞作为对照组进行观察。

1.3 实时荧光定量 PCR每1×106细胞中，加入1 mL TRIzol试剂，用1 mL移液枪吹至液体澄清且无细胞团块并转移入1.5 mL EP管中，按照TaKaRa公司总RNA提取试剂盒操作提取总RNA，并进行RNA定量。按照RT-PCR试剂盒将mRNA反转录为cDNA，按照Thermal Cycler DiceTMReal Time System(TaKaRa Code：TP800)使用说明书要求进行PCR试验操作。待测基因引物序列如下，ABCG2-F：5′-TGA GGG TTT GGA ACT GTG G-3′；ABCG2-R：5′-GAT TCT GAC GCA CAC CTG G-3′；GAPDH-F：5′-GGC ATC CTG GGC TAC ACT-3′；GAPDH-R：5′-CCA CCA CCC TGT TGC TGT-3′。定量PCR反应条件：95℃预变性30 s；95℃ 5 s，Tm 15 s，72℃ 30 s，45个循环；熔解曲线分析：95℃ 15 s，70℃ 15 s。每组实验重复3次，采用Livak法半定量分析RT-PCR检测结果。

1.4 Western印迹法检测蛋白表达水平 PBS洗涤细胞1次后，置于冰板上，用细胞刮子将细胞刮下收集，8 000 r/min×1 min离心得到细胞沉淀，每20 μL体积中加入100 μL RIPA细胞裂解液，冰上裂解30 min 后，超声破碎5次，每次2 s，15 000 r/min×10 min离心得到上清即为提取到的总蛋白样品。BCA法测定蛋白含量。蛋白样品按体积比3∶1加入上样缓冲液并煮沸5 min。制备8%SDS-PAGE，对样品进行电泳分离。电泳分离后，进行湿电转移，将蛋白转至PVDF膜。PVDF膜在含5%脱脂奶粉的TBST溶液中封闭1 h后，4℃孵育一抗过夜，相应二抗室温孵育1 h，ECL显影，Bio-Rad凝胶成像仪成像。

2 结 果

2.1 胃癌细胞悬浮球体的形成 在无血清培养基中，胃癌MKN45细胞培养4 d后开始逐渐形成细胞球体形状，继续培养，8～14 d形成较为完整的悬浮球体，球体中心细胞密度变大。继续培养至21 d，形成完整的悬浮球体，球体中心胃癌细胞密度增大，排列紧密(图1)。将第1代悬浮球体用滴管吹散后，在无血清培养基中继续培养，显微镜下观察，培养基中形成的细胞球体进一步增多，成球率高达(36.12±7.53)%。而原代贴壁培养细胞组成球率为(4.10±1.21)%，两组成球率差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 胃癌细胞MKN45无血清培养21 d后形成的悬浮球体

2.2 悬浮球细胞ABCG2的表达水平 实时荧光定量PCR结果(图2A)显示：悬浮球细胞ABCG2 mRNA表达水平高于原代贴壁细胞，差异有统计学意义(P<0.05)。Western印迹结果(图2B)显示：悬浮球细胞ABCG2蛋白表达水平高于原代贴壁培养细胞，差异有统计学意义(P<0.05)。

图2 原代贴壁细胞及悬浮球体细胞ABCG2的表达

3 讨 论

癌细胞的广泛侵袭和转移是胃癌患者最主要的死因，特别是难以控制的远隔重要脏器的转移[3]。CSCs在肿瘤转移过程中扮演的角色至关重要。ABCG2是ABC超家族成员之一，又被称为乳腺癌耐药蛋白，该蛋白作为外源性转运蛋白发挥作用，对化疗药物(包括米托蒽醌和喜树碱药物)的多药耐药起重要作用[4]。其在胎盘中表达显著增高，在母体循环中具有保护胎儿免受外来物质影响的作用，在肝脏和肾脏上皮细胞的顶端膜中，能够增强外源性物质的排泄[5]。在哺乳期的乳腺中，它具有将核黄素和生物素等分泌到乳汁中的作用；在肾脏和胃肠道中，它具有促进尿酸排泄的作用[6-7]。

ABCG2基因在许多恶性肿瘤细胞质膜上高表达，从而导致恶性肿瘤细胞能够将抗肿瘤药物泵出细胞外产生抗药性[8-9]。在对胶质瘤、黑素瘤等恶性肿瘤患者进行治疗的过程中，加入针对不同ABCG2突变体的拮抗剂可能会出现更好的疗效。进一步研究发现，ABCG2在胶质瘤、黑素瘤等肿瘤干细胞细胞膜上的表达特异性增高，提示ABCG2可能会成为这些肿瘤干细胞阳性筛选的潜在标志物[10]。

本研究结果显示，胃癌细胞株MKN45在含有FGF-2及EGF的无血清培养基中培养21 d，能够形成完整的悬浮球体，成球率明显高于原代贴壁细胞。

悬浮球体细胞内的ABCG2蛋白表达及mRNA表达水平均显著高于原代贴壁细胞，提示采用悬浮球培养法在胃癌细胞株MKN45中培养的悬浮球体细胞具有CSCs特性。该方法有望成为胃癌干细胞研究新的造模方法，为后续研究奠定了基础。