刘爱玲 刘爱胜 吴 敏

轮状病毒(rotavirus，RV)是1973年首次由澳大利亚Bishop等科学家所发现，是引起婴幼儿腹泻的主要病原体[1]。RV感染具有普遍性、易感性、易变异及RV血清型多等特点，且不同地区、不同年份RV流行特征明显不同，即使同一地区不同季节、不同年份RV感染和血清型流行情况也不一样，甚至同一地区同一种型别也可能存在多种毒株同时流行[2]。因此，不同地区、不同年份加强对RV感染和血清型流行特征进行不定时监测，对防治RV感染性婴幼儿腹泻具有重要意义。本研究对深圳市龙华区门诊腹泻婴幼儿的A组RV感染和G血清型、P血清分型情况进行了调查分析，为防治RV性腹泻提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2016年1月至2017年3月在深圳市龙华区人民医院门诊就诊的1033例腹泻婴幼儿的1033份粪便标本，其中男性438例，女性595例；年龄0～5岁，平均年龄(2±2.18)岁。按年龄将其分为＜0.5岁组(125例)、0.5～1岁组(492例)、1～3岁组(305例)和＞3岁组(111例)4组。门诊婴幼儿腹泻诊断标准：每日大便次数增加(≥3次)或大便性状发生明显改变(包括稀水样、蛋花样、黏液样或稀糊样等)[2-3]。该研究经医院医学伦理委员会批准后实施，并经婴幼儿家长知情同意并签定知情同意书。

1.2 仪器与试剂

CEQ8800型测序仪及配套试剂由美国Beckman公司提供；琼脂糖凝胶电泳仪及配套试剂由美国Bio-Rad公司提供；核酸提取试剂盒由美国Qiagen公司提供；RT-聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)试剂盒由美国Invitrogen公司提供；RV抗原检测试剂盒由艾博生物医药(杭州)有限公司提供。

1.3 检测方法

(1)标本采集。采集门诊腹泻婴幼儿急性期粪便，置于无菌容器内，立即送至检验科用胶体金免疫层析法进行RV抗原检查，对A组RV阳性的粪便标本用生理盐水混匀，制成10%的悬液，于-80℃保存，为进行RV的G血清型和P血清型分型备用。

(2)RV抗原检测。采用胶体金免疫层析法对腹泻标本中RV抗原进行检测，操作按试剂盒说明书进行。

(3)RV分型。①RV病毒核酸提取，RV病毒核酸提取严格按照试剂盒说明书进行，在提取的80 μl核酸标本中加入RNA酶抑制剂1.5 μl(40 U/μl)，于-80 ℃保存备用；②引物选择，采用套式PCR对RV病毒进行G血清型和P血清型分型。

(4)G血清型分型。一次放大采用编码VP7基因两端的保守序列设计引物(正链引物9Con1，负链引物9Con2)，放大基因的全长序列，二次放大正链引物选择基因的不同血清型的特征设计一组分型引物(9T1、9T2、9T3、9T4、9T9B)，正链引物为基因5’端保守序列的公用引物(9Con1)。这样从放大产物的特征分子量大小即可区别RV样品的不同血清型[4]。

(5)P血清型分型。引物设计原理与G血清型分型类似，一次放大引物(4Con3和4Con2)选择在VP4基因的高保守序列，二次放大负链引物选择一次放大基因区段内不同血清型的特征序列，设计一组分型引物(1T1、2T1、3T1、4T1、5T1)，正链引物仍采用5’端的公用引物(4Con3)，引物由美国Invitrogen公司合成[5]。引物序列见表1。

(6)巢式PCR。采用RT-PCR法对提取的核酸进行扩增。反应体系为模板RNA 1 μl，2×Reaction Mix(containing 0.4 mmol/L of each dNTP，3.2 mM MgSO)5 μl，引物0.15 μmol/L，SurperScriptTMⅢ RT/Platium Taq Mix 0.4 μ l， RNase inhibitor0.05 μl，总体积10 μl。

(7)RT-PCR反应。RT-PCR反应条件为50 ℃30 min→94 ℃ 10 min，然后94 ℃ 30 s→56 ℃ 30 s→68 ℃2 min，反复循环35次后于68 ℃延伸5 min。将RTPCR产物稀释100～10 000倍后进行PCR。PCR反应条件：94 ℃ 5 min，然后94 ℃ 30 s→58 ℃ 30 s→68 ℃90 s，反复运行25个循环后于68 ℃延伸7 min。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件对检测结果进行统计分析，计数资料采用率(%)表示，组间比较采用x2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 A组RV感染情况

在1033份门诊婴幼儿腹泻标本中共检出A组RV抗原436份，阳性率为42.21%(436/1033)，其中男性为44.06%(193/438)，女性为40.84%(243/595)，男性略高于女性，但差异无统计学意义(x2=1.032，P＞0.05)。

2.2 不同年龄婴幼儿A组RV感染情况

0.5～1 岁组婴幼儿A组RV感染率最高，阳性率为61.18%，明显高于其他年龄组，差异有统计学意义(x2=9.762，P＜0.05)，其次为1～3岁组，阳性率为33.11%，见表2。

表1 A组轮状病毒G和P分型引物序列情况

表2 不同年龄腹泄婴幼儿A组RV感染情况

表3 腹泄婴幼儿A组RV感染季节分布情况

2.3 A组RV感染季节分布情况

每年第4季度A组RV感染率最高，阳性率为53.54%，略高于1季度的47.99%，但差异无统计学意义(x2=1.032，P＞0.05)，但明显高于其他两个季度，差异有统计学意义(x2=4.135，x2=5.415；P＜0.05)，见表3。

2.4 A组RV的G血清型分布情况

4 3 6 例R V阳性标本中G 3血清型检出率最高，为53.21%(232/436)，明显高于G1血清型的31.42%(137/436)、G2血清型的2.75%(12/436)、G4血清型的2.06%(9/436)和G9血清型的1.61%(7/436)，其差异有统计学意义(x2=3.854，x2=6.751，x2=11.582，x2=19.192；P＜0.05)。不同G血清型混合感染率为4.59%(20/436)，且以混合感染G3G1血清型为主，占55.0%(11/20)。不能确定G血清型有19例，占4.36%。

2.5 A组RV的P血清型分布情况

436例RV阳性标本P[8]血清型检出率最高，阳性率为79.82%(348/436)株，明显高于P[1]血清型的5.28%(23/436)、P[4]血清型的2.52%(11/436)、P[9]血清型的1.83%(8/436)及P[6]血清型的1.61%(7/436)，差异有统计学意义(x2=27.025，x2=31.635，x2=40.924，x2=49.516；P＜0.05)。不同P血清型混合感染率3.90%(17/436)。未知P血清型22株，占5.05%(22/436)。

2.6 A组RV的G血清和P血清型混合感染情况

RV的G和P血清型混合感染主要见于G3P[8]和G1P[8]血清型，阳性率分别为43.58%(190/436)和28.90%(126/436)，其次为G2P[8]血清型和G3G1P[8]血清型。此外，还检测到其他较少见的混合感染株，见表4。

表4 腹泄婴幼儿不同RV的G和P血清型混合感染情况

2.7 凝胶电泳分析

取3～8 μl的PCR产物，采用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行检测(60 min/120 V)，并采用凝胶成像分析系统分析电泳结果，如图1、图2所示。

图1 轮状病毒RT-PCR特异性产物电泳图

图2 RV PCR阳性产物测序图

3 讨论

随着抗生素的广泛应用，以及人们生活水平的提高及卫生习惯的改善，细菌性腹泻得到了有效控制，而病毒性感染成为全球婴幼儿急性腹泻的重要原因[6]。RV感染性腹泻是婴幼儿常见疾病之一，临床主要表现为腹泻和呕吐，各个年龄段均有发生，主要易发于儿童、老年人、旅游者及免疫受抑制者， 尤其是婴幼儿，不仅发病率高，而且是婴幼儿死亡的主要原因之一，仅次于肺炎排在第2位[7]。2008年据世界卫生组织(WHO)统计，RV感染造成约45万幼婴儿死亡，其中大约90%RV感染死亡病例发生在亚洲和非洲，我国每年约4万婴幼儿死于RV感染性腹泻[8-9]。目前，尚无治疗RV感染性婴幼儿腹泻的特效方法，主要采用对症治疗，纠正脱水和维持电解质平衡。因此，监控和预防RV感染具有重要意义[10]。

不同地区和不同年份A组RV感染率差别相差很大，国内外大多数文献报导A组RV感染率处于31%～68%之间，且不同性别婴幼儿之间感染率差异不大。本研究结果显示，2016年1月至2017年3月深圳龙华区门诊腹泻婴幼儿A组RV感染率为42.21%，明显低于王琼等[11]报导2007-2009年深圳地区的52.5%，而明显高于徐丹等[12]报导2010-2013年深圳南山区的30.35%和卢丽娟等[13]报导2008-2011年上海地区的36.0%，这可能与不同地区和年份研究婴幼儿年龄大小、检测方法、生活水平、接种疫苗、预防知识宣传及标本收集的季节性等原因存在很大差异有关。且不同性别婴幼儿RV感染率之间差异无统计学意义，这可能与该年龄的婴幼儿免疫力、生活方式及基础生理等因素相差不大有关。

本研究结果显示，A组RV好发0.5～1岁组，其感染率明显高于其他年龄组，差异有统计学意义，与国内外大部分研究结果相一致[4-14]。这可能与此时婴幼儿从母体获得被动免疫能力逐渐消耗完，而自体主动免疫尚未完全成熟，对各种病原感染的特异性IgM抗体产生不足等有关外，还与该年龄段婴幼儿已经添加辅食，人工喂养，肠道局部分泌型IgA(sIgA)减少，较易感染各类病原体等有关。＜6个月的婴幼儿感染率较低，这可能与该年龄段的婴儿大多处于母乳喂养期，乳汁中大量sIgA可以起到保护其肠道黏膜的作用及从母体获得被动免疫能力尚在等因素有关。2岁以上的婴幼儿RV感染率逐渐下降，这可能与婴幼儿自身sIgA增高、自体主动免疫逐渐成熟及抵抗力逐渐增强等因素有关。因此，加强饮食和环境卫生、切断传播途径、提高儿童主动免疫水平是预防RV感染性婴幼儿腹泻重要环节。

目前，全球全年均可发生RV感染，但发病高峰多为温带地区的秋冬季节，具有明显的季节性，与温度变化有密切关系[15]。本研究结果显示，A组RV好发于每年的第4季度和第1季度，明显高于其他两个季度，与国内外大部分文献报导相一致[15-16]。这可能与第4季度和第1季度天气寒冷、温差大、婴幼儿容易着凉及寒冷干燥天气有利于A组RV生长繁殖等因素有关。

A组RV的外衣壳蛋白VP4和VP7基因，具有型特异性抗原决定簇，可诱导机体发生免疫应答产生特异性中和抗体，同时也作为RV血清基因型的分型依据。根据A组RV的VP7和VP4核酸序列差异可分为27种G基因型和35种P基因型，且G和P血清型可自由组合形成混合感染[11]。因此，不同地区、不同年份A组RV的G和P型别及组合均可能不一致，形成RV复杂多变的分子流行特征。本研究结果显示，2016年1月至2017年3月A组RV的G血清型以G3和G1感染为主，阳性率分别为53.21%和31.42%，而P血清型以P[8]感染为主，阳性率为79.82%，其次为P[1]型，阳性率为5.28%，与有关文献报导相一致[11-16]。但混合感染类型较上述文献报导的要复杂一些，产生了3种甚至4种血清型混合感染，主要以G3P[8]和G1P[8]为主，阳性率分别为43.58%和28.90%，其次为G2P[8]和G3G1P[8]，这可能与A组RV治疗药物和口服疫苗的不断使用，导致A组RV不断发生变异有关。

A组RV是门诊婴幼儿腹泻主要病原体之一，好发于每年第4季度和第1季度的0.5～1岁婴幼儿，且血清型混合感染类型越来越复杂。目前缺乏针对RV感染的特效药物，接种RV疫苗是预防RV感染最有效方法，但不同血清型之间缺乏有效的交叉保护作用，不同地区、不同年份A组RV感染率及血清型流行具有很大差异性，并不断出现一些新流行毒株，在一定程度地妨碍了接种RV疫苗的效果[17]。因此，不同地区或同一地区不同年份对A组RV感染和血清型流行情况进行不定时监测，对防治RV感染及疫苗的改进和推广具有重要的意义。