王 琦

（长治学院 生物科学与技术系，山西 长治 046011）

1 引言

蛋白质是食物的重要营养成分，对机体的生长、发育具有不可替代的作用。大米中所含蛋白因赖氨酸、苏氨酸等几种必需氨基酸的含量比其它禾谷类高[1]，具有很高的营养价值。然而，当前以乳制品和粮食为代表的食品原料存在着较为严重的掺假现象，近年来陆续报道在粮食和乳制品中非法添加三聚氰胺等非蛋白含氮物质[2-4]。为降低生产成本，部分企业和商家向大米产品中添加非蛋白含氮物质以冒充高蛋白产品，干扰了市场秩序，对人体健康形成危害。

目前，国家标准规定的测定蛋白含量的方法是凯氏定氮法，其原理是通过检测食品中氮的总含量来计算蛋白质含量，而非直接测量。此方法的弊端是在测定含有非蛋白氮的样品时，结果会受到不同程度的干扰，从而使得蛋白质的表观含量有所偏高[5]。针对该问题，建立一种不受非蛋白氮等其他因素干扰、能够较准确地测定样品中蛋白的方法来做为凯氏定氮法的补充就显得势在必行。

之前有学者采用考马斯亮蓝法（简称CBB法）测定了牛奶中蛋白质含量，发现在一定浓度范围内，三聚氰胺、尿素和毛发水解物均不会对牛奶中蛋白质含量的测定结果造成干扰[6-9]。文章将以此为基础，针对不同干扰物对三种大米蛋白含量测定方法的影响进行探究，旨在找到一种不受非蛋白含氮物干扰的测定来做为凯氏定氮法的补充，为相关食品检验提供一份有价值的参考数据。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 材料与试剂

大米粉、结晶牛血清白蛋白（BSA）、浓硫酸、硫酸钾、硫酸铜、硼酸、甲基红、考马斯亮蓝试剂（CBB试剂）、福林-酚试剂（Lowry试剂）。

2.1.2 仪器与设备

725S可见分光光度计、DK-S24型数显电热恒温水浴锅、BCD-290W型电子天平、K9840型全自动凯氏定氮仪、SH220型石墨消解仪。

2.2 方法

2.2.1 标准曲线的绘制

分别利用考马斯亮蓝G-250法（Bradford法）和福林-酚试剂法（Lowry法）绘制标准曲线[10]。

2.2.2 大米中蛋白质提取的正交实验

文章采用碱消化法，依据下表所取NaOH浓度、温度及时间，采用L9（34）正交表进行正交筛选实验。

表1 正交实验反应体系Table 1 Orthogonal experiment reaction system

图1 考马斯亮蓝标准曲线数据图

表2 考马斯亮蓝正交实验结果和极差分析Table2 Coomassie brilliant blue of orthogonal experiment,the results and extreme difference analysis

2.2.3 大米中蛋白质含量测定方法比较

将大米粉以筛选的最佳消化条件进行处理，分别以CBB法和Lowry法测定蛋白质含量，并与凯氏定氮法测定结果作比较。

2.2.4 添加干扰物实验比较

大米粉中添加无机非蛋白氮化合物对CBB法、Lowry法测定的影响，进一步确定方法的准确性和精确度。

3 结果

3.1 标准曲线的绘制

由图1、2结果可以看出，测定的标准曲线线性回归方程良好（R2>0.99），满足后续实验要求。

3.2 正交实验

3.2.1 极差分析

表3 Lowry正交实验结果和极差分析

表2 考马斯亮蓝正交实验结果和极差分析Table 3 Lowry orthogonal experiment results,and extreme difference analysis

由表2、3可以看出，影响考马斯亮蓝法的主次因素是A（NaOH浓度）；B（温度）；C（时间），其最优条件是：A3B2C1，即：0.1 mol/L NaOH，35℃，60 min；而影响Lowry法的主次因素是A（NaOH浓度）；B（温度）；C（时间），其最优条件是：A3B2C1，即：0.1 mol/L NaOH，35℃，60 min。

3.2.2 方差分析

通过对表2，3的数据进行整理，分别绘制出两种方法的方差分析表，见表4、5。

表4 考马斯亮蓝方差分析表Table 4 Coomassie brilliant blue difference analysis table

表5 Lowry方差分析表Table 5 Lowry anova table

据表4、5可以得出，因素A高度显著，因素B显著，因素C不显著。因素主次顺序A-B-C，与极差分析基本吻合。对因素A、B分析，确定优水平为A3、B2；因素C的水平改变对试验结果几乎无影响，可从经济、操作等角度考虑取值，选C1。最优水平组合为 A3B2C1。即：0.1 mol/L NaOH，35℃，60 min；结合极差分析和方差分析可得采用考马斯亮蓝法测得的最优蛋白含量为7.14%，采用Lowry法测得的最优蛋白含量为9.26%，二者分别与凯氏定氮法测得的含氮量8.7%相比，可知Lowry法准确度更高。

3.3 三种测定方法的比较

由表6可以看出，CBB法测定蛋白质含量的结果较凯氏定氮法明显偏低，从78.22%到80.33%不等。考马斯亮蓝主要与蛋白质中的碱性氨基酸和芳香族氨基酸结合，而不同种类的蛋白质中以上两类氨基酸的含量和比例差别较大。Lowry法的测定结果与凯氏定氮法相比则表现出基本接近的趋势，这是因为在Lowry法的显色反应中起作用的有两方面的因素：一是蛋白质肽链中的肽键与碱性铜溶液中的Cu2+结合在碱性条件下可以形成络合物；二是络合物将酚试剂还原生成钼蓝-钨蓝蓝色化合物，两步反应叠加的效果是减弱了因蛋白质种类所导致的误差。

表6 凯氏定氮法、CBB法和Lowry法测定结果比较Table 6 Comparison of determination results by Kjeldahl,CBB and Lowry Method

3.4 干扰物添加实验比较

表7 大米样品添加干扰物实验结果Table 7 Interference effect of supplements to protein determination of rice

由表7实验结果表明，本次实验尝试的非蛋白氮干扰物中，三聚氰胺的加入量低于300 g/kg时，对测定结果无明显干扰作用，误差基本保持在3%以内，相比而言，对CBB法的影响更大一点。尿素的含量在低于100 g/kg时，对测定结果基本没有影响，而随着加入量的继续增加，CBB法和Lowry法的测定数据均有一定程度的下降，其中CBB法表现更为明显。硫酸铵对蛋白质含量的测定的影响最为微弱，添加量超过50 g/kg时，蛋白质的测定结果反而呈现下降的趋势。

4 讨论

（1）凯氏定氮法不是直接测出蛋白质的含量，而是通过测定样品中氮元素的总含量来间接计算蛋白含量。通常情况下，粮食和食品中的含氮物质主要是蛋白质，因此利用凯氏定氮法测蛋白含量一般来说比较可靠。可是，一旦有人在样品中添加非蛋白含氮物质，这个方法就不那么准确了，蛋白质含量的测定结果会不同程度地偏高，从而带有虚假性和误导性。

（2）CBB法操作简单，只需加入一种染料；反应迅速，大约要2 min可以完成，且显色结果能在1 h之内保持稳定，较Lowry法省时。但此法的缺点是由于考马斯亮蓝G-250与不同种类蛋白质的结合能力存在差异，因此可能引起不同程度的偏差。本次实验结果与凯氏定氮法相比有较明显的偏低，从78.22%到80.33%不等[11-13]。

（3）Lowry法作为一种公认的测定微量蛋白的方法，因其作用机制是由两步叠加的显色反应组成，克服了CBB法由蛋白质种类引起偏差的缺点[14-17]。但是Lowry法存在试剂乙的配制较为繁琐、需严格控制反应时间以及耗时长等弊端，不过可以利用商品化的试剂盒，解决这一问题。本实验的蛋白质含量测定的结果与凯氏定氮法相当，与前人文献所述大体相同[18,19]。

三种方法对标准蛋白和大米蛋白的测定结果显示：Lowry法的测定数据与凯氏定氮法的符合度达到90%以上，而CBB法的测定结果则较凯氏定氮法呈现偏低的趋势，平均符合度为70%～80%，从而得出：Lowry法准确度更高。

5 结论

文章在非蛋白氮干扰物的添加实验中，采用CBB法和Lowry法作为蛋白质含量的测定方法时，三种干扰物对大米蛋白质含量的测定结果均无明显干扰作用。三聚氰胺在加入量低于300g/kg时对CBB法和Lowry法的测定结果基本无影响；尿素和硫酸铵对这两种方法测定结果的干扰也较小，随着添加量的增加，蛋白质含量的测定结果反而呈现下降趋势。三聚氰胺作为一种化工原料，动物（及人类）长期摄入会造成生殖、泌尿系统的损害，引起尿路结石，所以我国严禁在食品、饲料中添加三聚氰胺。结合本实验结果，我们可以推测：在加强国家食品药品监管力度的同时，以凯氏定氮法为参考，选用其他一种或多种蛋白质检测方法，尽量降低甚至避免非蛋白氮的干扰，以求更加准确地测定食品和饲料中蛋白质的实际含量，为人类和动物的健康筑起一道坚固的防线。